© Borgis - Postepy Fitoterapii 3, s. 163-166
*Anna Głowacka1, Mariusz Mianowany1, Danuta Trojanowska2, Alicja Budak2
Ocena aktywności przeciwgrzybiczej wyciągu wodnego z wierzbownicy drobnokwiatowej (Epilobium parviflorum Schreb.) wobec dermatofitów z gatunku Trichophyton mentagrophytes
Estimation of antifungal activity of the small-flowered willow (Epilobium parviflorum Schreb.) aqueous extract against dermatophytes from species of Trichophyton mentagrophytes
1Zakład Biologii Środowiskowej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Anna Głowacka, prof. nadzw.
2Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. farm. Alicja Budak
Summary
Despite the small-flowered willow herb’s corroborated curative traits, an array of synthetic agents has dislodged it for long from medicine. Albeit research works in the domain of phytochemistry and pharmacognosy that were conducted in the last two decades reconsidered the medicinal properties of Epilobium parviflorum. The most active are willow herb aqueous dry extracts which display antibacterial, antifungal, anti-tumour, immune-stimulating, anti-inflammatory and detoxifying activities. The willow herb extracts are applicable to therapy of dermatoses and systemic autoimmune diseases.
The aim of the study was to assess the antifungal in vitro activity of different concentrations of Epilobium parviflorum aqueous dry extract against Trichophyton mentagrophytes strains isolated from nail filings of patients attending the Dermatological Clinic within the Ludwik Rydygier Specialistic Hospital in Krakow, and one original strain ATCC 18748.The research material were nine Trichophyton mentagrophytes strains, including one original strain ATCC 18748 and eight strains isolated from the nail filings. Moreover, there was used the small-flowered willow herb aqueous dry extract which was diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO), given the concentrations: 200, 100, 50, 25 and 12.5 mg/ml. In order to assess the antifungal activity of the Epilobium parviflorum extract, in the five concentrations, the disc-diffusion method was employed. A measure of the antifungal activity of the small-flowered willow herb aqueous dry extract was its minimal inhibitory concentration (MIC).Diameters of growth inhibition zones in case of the Trichophyton mentagrophytes isolates, exposed to the action of five concentrations of the studied extract, contingently on the concentration amounted to 18-26 mm at the outmost (21.75 ± SD = 2.92 mm on the average), given the concentration 200 mg/ml, and 6-7 mm at the very least (6.25 ± SD = 0.46 mm on the average), given the concentration 12.5 mg/ml. The diameters of growth inhibition zone in case of the Trichophyton mentagrophytes demonstration strain ATCC 18748, exposed to the action of five concentrations of willow herb extract, maximally amounted to 22 mm, given the concentration 200 mg/ml, and minimally to 6 mm, given the concentration 12.5 mg/ml. The minimal inhibitory concentration (MIC) of the Epilobium parviflorum extract for the eight investigated Trichophyton mentagrophytes isolates came to 9.25 mg/ml.The corroborated antifungal activity of the Epilobium parviflorum aqueous dry extract countenances admitting it to be a potent natural preparation which can be applicable to therapy of ringworm of the foot and scalp.
Key words: trichophyton mentagrophytes, epilobium parviflorum –antifungal activity, minimal inhibitory concentration
Wprowadzenie
Pierwsze wzmianki o leczniczych właściwościach wierzbownicy drobnokwiatowej (Epilobium parviflorum Schreb.) pochodzą jeszcze z 1880 roku. Mimo uznanych właściwości leczniczych tej rośliny, leki syntetyczne na długie lata wyparły ją z medycyny (1, 2). Przeprowadzone w ostatnim dwudziestoleciu badania fitochemiczne i farmakognostyczne w Polsce oraz na świecie, ponownie wykazały właściwości lecznicze E. parviflorum (3, 4). Ziele wierzbownicy drobnokwiatowej (Epilobii herba) bogate jest w substancje biologicznie czynne, ponieważ zawiera β-sitosterole oraz kwasy: linolenowy, arachidonowy, arachidowy, olejowy, palmitoolejowy, palmitynowy, stearynowy (frakcja lipidowa) oraz mirycetynę, kwercetynę i kemeferol (frakcja flawonoidowa). Szczególnie aktywne są wyciągi wodne z wierzbownicy, które wykazują działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe, immunostymulujące, przeciwzapalne i odtruwające (5-9).
Wyciągi z wierzbownicy zalecane są w przypadku chorób skórnych (łuszczyca, trądzik, wypryski, dermatozy, pokrzywka, łojotok, łojotokowe zapalenie skóry, figówka, ropne zapalenie mieszków włosowych, łupież tłusty, dermatoza okołoustna) i chorób autoimmunologicznych układowych. Stosowane są także w przeroście i stanach zapalnych gruczołu krokowego, kamicy moczowej, zapaleniach układu moczowego i płciowego zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn. Wyciągi z wierzbownicy znalazły również zastosowanie w leczeniu chorób wywołanych nadmiarem androgenów, w zaburzeniach miesiączkowania, upławach, przy bólach i zawrotach głowy, nerwobólach, bezsenności, moczeniu nocnym, wyczerpaniu nerwowym, trudno gojących się ranach, chorobach alergicznych i łysieniu androgennym (10-12).
Cel pracy
Celem pracy była ocena in vitro aktywności przeciwgrzybiczej różnych stężeń suchego wodnego wyciągu z ziela wierzbownicy drobnokwiatowej wobec szczepów grzybów z gatunku Trichophyton mentagrophytes wyizolowanych od pacjentów chorych na grzybicę paznokci.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiło dziewięć szczepów T. mentagrophytes, w tym jeden szczep wzorcowy ATCC 18748 i osiem szczepów klinicznych wyizolowanych z opiłków paznokci pacjentów leczonych w Poradni Dermatologicznej Szpitala Specjalistycznego im. Ludwika Rydygiera w Krakowie. Do badań wykorzystano suchy wodny wyciąg z ziela wierzbownicy (Epilobium aquaesiccum), wyprodukowany przez Phytopharm Klęka S.A. w 2011 r., z którego sporządzono roztwory w dimetylosulfotlenku (DMSO) o stężeniach: 200, 100, 50, 25 i 12,5 mg/ml.
Wyizolowane szczepy T. mentagrophytes wysiewano na stałe podłoże Sabourauda z dodatkiem aktidionu i po 7-10-dniowej inkubacji w temperaturze 27°C przygotowywano zawiesinę w 0,85% roztworze NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda.
Do oceny aktywności przeciwgrzybiczej pięciu rozcieńczeń suchego wyciągu z ziela wierzbownicy zastosowano metodę dyfuzyjno-krążkową. Przygotowane zawiesiny badanych szczepów w ilości 100 μl wysiewano na stałe podłoże Sabourauda z aktidionem, a następnie nakładano przygotowane krążki bibułowe, które zawierały po 15 μl odpowiednich stężeń roztworów suchego wyciągu z wierzbownicy. Hodowle inkubowano w temperaturze 27°C przez 7-10 dni, a następnie mierzono średnicę strefy zahamowania wzrostu grzyba wokół każdego krążka w mm, przyjmując średni pomiar z dwóch prostopadłych do siebie średnic.
Minimalne stężenie hamujące MIC (w mg/ml) obliczono z krzywej wzrostu prostoliniowego wykreślonej w układzie półlogarytmicznym, odkładając na osi odciętych logarytmy wartości stężeń roztworów z wierzbownicy (200, 100, 50, 25 i 12,5 mg/ml), a na osi rzędnych średnicę pola zahamowania wzrostu grzyba wokół krążka. Miarą przeciwgrzybiczego działania roztworu wierzbownicy było ich najmniejsze stężenie hamujące MIC (minimal inhibitory concentration) obliczone wg wzoru Kadłubowskiego (13) z poprawką Głowackiej:
| logMIC=logC1+ | logC2 – logC1 | |
| N2–N1 |
gdzie:
N1, N2 – średnie arytmetyczne dwóch grup średnic stref zahamowania wzrostu, średnica krążka 6 mm,
logC1, logC2 – średnie arytmetyczne logarytmów dwóch grup stężeń używanego preparatu.
Średnice obszaru zahamowania wzrostu grzybów z gatunku T. mentagrophytes opisywano za pomocą wartości średniej, błędu standardowego, odchylenia standardowego, przedziału ufności dla średniej oraz wartości minimalnej i maksymalnej cechy. Przedział ufności ustalono na poziomie 95%.
Wyniki
Średnice stref zahamowania wzrostu szczepów T.mentagrophytes poddanych działaniu pięciu stężeń roztworu wyciągu wodnego z wierzbownicy drobnokwiatowej wynosiły maksymalnie 18-26 mm (średnio 21,75 ± SD = 2,92 mm) przy stężeniu 200 mg/ml, a minimalnie 6-7 mm (średnio 6,25 ± SD = 0,46 mm) przy stężeniu 12,5 mg/ml.
Średnice stref zahamowania wzrostu szczepu wzorcowego T. mentagrophytes (ATCC 18748), poddanego działaniu pięciu stężeń roztworu wyciągu z wierzbownicy drobnokwiatowej, wynosiły maksymalnie 22 mm, przy stężeniu 200 mg/ml oraz minimalnie 6 mm, przy stężeniu 12,5 mg/ml.
Minimalne stężenie hamujące (MIC) roztworu wyciągu wodnego z wierzbownicy drobnokwiatowej dla ośmiu badanych szczepów T. mentagrophytes wyizolowanych od pacjentów wynosiło średnio 9,25 mg/ml (tab. 1).
Tabela 1. Strefy zahamowania wzrostu (mm) Trichophyton mentagrophytes pod wpływem różnych stężeń wyciągu wodnego z wierzbownicy (mg/ml) dla szczepu wzorcowego i 8 szczepów wyizolowanych od pacjentów.
| L.p. | Gatunek | Nr szczepu | Materiał kliniczny | Stężenie roztworu wierzbownicy (mg/ml) |
| 200 | 100 | 50 | 25 | 12,5 |
| Strefa zahamowania wzrostu (mm) |
| 1. | T. mentagrophytes | ATCC 18748 | szczep wzorcowy | 22 | 16 | 11 | 8 | 6 |
| 2. | T. mentagrophytes | 2/07 | opiłki paznokci | 26 | 20 | 12 | 9 | 7 |
| 3. | T. mentagrophytes | 167/07 | opiłki paznokci | 26 | 20 | 12 | 9 | 6 |
| 4. | T. mentagrophytes | 11/09 | opiłki paznokci | 22 | 16 | 10 | 8 | 6 |
| 5. | T. mentagrophytes | 190/10 | opiłki paznokci | 22 | 15 | 8 | 7 | 6 |
| 6. | T. mentagrophytes | 86/07 | opiłki paznokci | 20 | 16 | 13 | 8 | 6 |
| 7. | T. mentagrophytes | 1/07 | opiłki paznokci | 20 | 16 | 8 | 6 | 6 |
| 8. | T. mentagrophytes | 8/07 | opiłki paznokci | 20 | 14 | 10 | 7 | 6 |
| 9. | T. mentagrophytes | 149/07 | opiłki paznokci | 18 | 16 | 13 | 9 | 7 |
Obliczenia statystyczne stref zahamowania wzrostu (mm) dla ośmiu szczepów T. mentagrophytes wyizolowanych od pacjentów pod wpływem różnych stężeń roztworu wyciągu wodnego z wierzbownicy drobnokwiatowej przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 2. Obliczenia statystyczne stref zahamowania wzrostu (mm) dla 8 szczepów Trichophyton mentagrophytes wyizolowanych od pacjentów pod wpływem różnych stężeń roztworu wyciągu wodnego z wierzbownicy (mg/ml).
| Stężenie roztworu wierzbownicy (mg/ml) | Parametry statystyczne stref zahamowania wzrostu (mm) |
| Średnia | Odchylenie standardowe | Błąd standardowy | Przedział ufności 95% | Minimum | Maksimum |
| Lp. |
| 1. | 200,00 | 21,75 | 2,92 | 1,03 | 19,31 – 24,19 | 18 | 26 |
| 2. | 100,00 | 16,63 | 2,20 | 0,78 | 14,79 – 18,46 | 14 | 20 |
| 3. | 50,00 | 10,75 | 2,05 | 0,73 | 9,03 – 12,47 | 8 | 13 |
| 4. | 25,00 | 7,88 | 1,13 | 0,40 | 6,93 – 8,82 | 6 | 9 |
| 5. | 12,50 | 6,25 | 0,46 | 0,16 | 5,86 – 6,64 | 6 | 7 |
Omówienie
Wierzbownica jest rośliną zielną, należącą do rodziny wiesiołkowatych. Rodzaj wierzbownica obejmuje szereg gatunków, nie wszystkie jednak wykazują działanie lecznicze. Do gatunków leczniczych należy, m.in. wierzbownica drobnokwiatowa (E. parviflorum), która najczęściej wykorzystywana jest w medycynie ludowej. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie środowisk naukowych, co zaowocowało rozpoczęciem badań nad jej wykorzystaniem w terapii na szeroką skalę (5- 9).
Ducrey i wsp. (1) badali wpływ wyciągu z wierzbownicy (rodzaj: Epilobium, rodzina: Onagraceae – Oenotheraceae) na aktywność dwóch enzymów – 5-α-reduktazy i aromatazy – mających istotne znaczenie w etiologii łagodnego rozrostu stercza. Posługując się technikami laboratoryjnymi, autorzy pracy zidentyfikowali dwa wielopierścieniowe związki chemiczne z grupy elagotanin, wchodzące w skład wyciągu z wierzbownicy, tj. oenoteinę A i oenoteinę B, które hamowały aktywność 5-α-reduktazy i aromatazy.
Badania nad wpływem różnych wyciągów z wierzbownicy drobnokwiatowej (E. parviflorum) na aktywność 5-α-reduktazy przeprowadzili również Lesuisse i wsp. (2). Do badań użyto specjalnie przygotowanych homogenatów z gruczołu krokowego mężczyzn z rozpoznanym łagodnym rozrostem stercza. Do oceny wpływu badanych wyciągów z ziela wierzbownicy drobnokwiatowej na aktywność 5-α-reduktazy autorzy wykorzystali metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (high-performance liquid chromatography, HPLC). Badacze wykazali, że najsilniejszym wpływem hamującym na 5-α-reduktazę charakteryzowały się wyciągi wodne z ziela wierzbownicy. Potwierdzili oni tym samym, że znany od 130 lat wśród ludowych medyków naturalny środek – wyciąg z ziela wierzbownicy drobnokwiatowej – wykazuje wysoką wartość terapeutyczną. Substancją, która według obserwacji autorów wykazywała największą aktywność inhibującą wobec 5-α-reduktazy, była wielopierścieniowa tanina – oenoteina B (substancja, której właściwości przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe udowodniono już we wcześniejszych latach).
Vitalone i wsp. (9) przeprowadzili badania in vitro dotyczące przeciwdrobnoustrojowego działania wyciągów alkoholowych z wierzbownicy. Do badań wykorzystano takie gatunki, jak E. angustifolium, E. hirsutum, E. palustre, E. tetragonum i E. rosmarinifolium. W badaniach wykorzystano bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne oraz grzyby drożdżoidalne z rodzaju Saccharomyces. Wszystkie użyte w badaniu suche wyciągi charakteryzowały się działaniem przeciwdrobnoustrojowym w zakresie stężeń od 10 do 650 μg/ml. Najszersze spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego wobec badanych szczepów bakterii i grzybów drożdżoidalnych wykazywały wyciągi z ziela wierzbownicy E. angustifolium i E. rosmarinifolium.
Leczenie grzybic powierzchniowych wywołanych przez dermatofity jest w zależności od zaawansowania choroby długotrwałe i kosztowne. Stosowanie leczenia skojarzonego, czyli terapii doustnej uzupełnionej preparatami zewnętrznymi, może skrócić czas leczenia. Wysoka aktywność wyciągu wodnego z ziela wierzbownicy daje możliwość zastąpienia nim drogich leków do stosowania miejscowego w postaci lakierów do paznokci lub żeli przeciwgrzybiczych. Ziele wierzbownicy drobnokwiatowej (E. parviflorum Schreb.) może zatem posłużyć do przygotowania preparatów do stosowania zewnętrznego (tonik, maść, serum, płyny lecznicze do skóry głowy) (14, 15).
Podsumowanie
Potwierdzona aktywność suchego wodnego wyciągu z ziela wierzbownicy drobnokwiatowej (Epilobium parviflorum Schreb.) na dermatofity z gatunku Trichophyton mentagrophytes, pozwala uznać go za skuteczny naturalny preparat, który może mieć zastosowanie w leczeniu grzybicy paznokci i innych grzybic wywołanych przez ten drobnoustrój.
Piśmiennictwo
1. Ducrey B, Marston A, Göhring S i wsp. Inhibition of 5-α-re-ductase and aromatase by the ellagotannins oenothein A and oenothein B from Epilobium species. Planta Med 1997; 63:111-4. 2. Lesuisse D, Berjonneau J, Ciot C i wsp. Determination of oenothein B as the active 5-reductase-inhibiting principle of the folk medicine Epilobium parviflorum. J Nat Prod 1996; 59:490-2. 3. Nowak R, Krzaczek T. Farmakognostyczne badania ziela Epilobium angustifolium i Epilobium parviflorum Schreb. Herba Pol 1998; 44(1):5. 4. Nowak R, Krzaczek T. Sterole w zielu Epilobium angustifolium L. Herba Pol 1998; 44(4):297. 5. Awad AB, Fink CS. Phytosterol as anticancer dietary components: Evidence and mechanisms of action. J Nutrit 2000; 130:2127-30. 6. Dreikorn K. The role of phytotherapy in treating lower urinary tract symptoms and benign prostatic hyperplasia. World J Urol 2002; 19(6):426-35. 7. Vitalone A, Bordi F, Baldazzi C i wsp. Anti-proliferative effect on a prostatic epithelial cell line (PZ-HPV-7) by Epilobium angustifolium L. Farmaco 2001; 56:483-9. 8. Battinelli L, Tita B, Evandri MG i wsp. Antimicrobial activity of Epilobium spp. extracts. Farmaco 2001; 56:345-8. 9. Vitalone A, McColl J, Thome D i wsp. Characterization of the effect of Epilobium extracts on human cell proliferation. Pharmacology 2003; 69:79-87. 10. Mowszowicz J. Pospolite rośliny naczyniowe Polski. Wyd Nauk PWN. Warszawa 1979. 11. Różański H. Wierzbownica i wierzbówka – Epilobium L. et Chamaenerion Adans (rodzina Oenotheraceae sivepotius Onagraceae – Wiesiołkowate). Właściwości lecznicze, preparaty, zastosowanie, dawkowanie. AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu. Poznań 2004-2005. 12. Treben M. Health through god’s pharmacy, 3rded. Wilhelm Ennsthaler, Steyr 1984. 13. Kadłubowski R. Approximate methods in analysis of dose/response curve. Abstracts of VIIth Intern Congr Chemother. Praha 1971; A-12/28. 14. Nowicki R. Grzybica paznokci – jak usprawnić leczenie. Porady praktyczne nie tylko dla dermatologów. Przew Lek 2002; 5:52-8. 15. Szepietowski J, Reich A. Co nowego w diagnostyce i terapii w dermatologii. Przew Lek 2007; 2:160-7.
otrzymano/received: 2013-06-11
zaakceptowano/accepted: 2013-07-10
Adres/address:
*dr hab. n. med. Anna Głowacka, prof. nadzw.
Zakład Biologii Środowiskowej Uniwersytet Medyczny w Łodzi
ul. Żeligowskiego 7/9, 90-752 Łódź
tel.: +48 (42) 658 58 52, +48 (42) 272 52 01
e-mail: anna.glowacka1@umed.lodz.pl
