© Borgis - Postepy Fitoterapii 3, s. 152-156
*Bogdan Kędzia, Elżbieta Hołderna-Kędzia
Dekontaminacja mikrobiologiczna pyłku kwiatowego przy użyciu energii jonizującej**
The microbiological decontamination of pollen by using of ionizing radiation
Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Grzegorz Spychalski
Summary
The studies included 5 samples of pollen. For the decontamination was used a linear accelerator producing a free electrons flux. The samples of pollen were irradiated with a dose 10 kGy. This process reduced the amount of microorganisms at the average from 34 600 to 26 in 1 g – it is about 99.925%. The antibiotic activity and contents of biological active compounds such flavonoids and fatty acids including NNKT were not affected by parameters of ionizing radiation. The conducted studies show that the decontamination of pollen by using of ionizing energy let obtain a product with a high microbiological purity and unchanged biological activity.
Key words: pollen, ionizing radiation, microbiological decontamination, biological activity
Pyłkiem kwiatowym, jako jednym z produktów pszczelich, nazywany jest pyłek zbierany przez pszczoły z pylników kwiatów i przenoszony przez nie w postaci obnóży do ula.
Źródłem zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami są z jednej strony ziarna pyłku, a z drugiej strony wydzielina z przewodu pokarmowego pszczół, która używana jest do formowania obnóża.
W materiale roślinnym występują liczne bakterie saprofityczne (1), głównie ziarniaki Gram-dodatnie z rodzajów Enterococcus i Micrococcus, pałeczki Gram--ujemne fermentujące z rodzajów Enterobacter, Serratia, Hafnia, Cedacea i Erwinia oraz niefermentujące z rodzajów Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Alcaligenes i Aerobacter, laseczki tlenowe z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium i grzyby pleśniowe z rodzajów Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Fusarium, Alternaria, Cladosporium i Trichothecium oraz grzyby drożdżoidalne z rodzajów Rhodotorula i Geotrichum. Występowanie wymienionych drobnoustrojów w pyłku kwiatowym potwierdzają liczne publikacje (2-4).
Z kolei flora jelitowa zdrowej pszczoły (5) jest zdominowana przez bakterie Gram-ujemne, głównie z rodziny Enterobacteriaceae, które stanowią ok. 70% całej populacji drobnoustrojów. Około 25% przypada na laseczki Gram-dodatnie z rodzaju Bacillus i pałeczki Gram-dodatnie z rodzaju Lactobacillus. Wśród pozostałych drobnoustrojów występują m.in. grzyby drożdżoidalne.
Ponadto w pyłku kwiatowym mogą znaleźć się także przetrwalniki chorobotwórczych dla pszczół laseczek tlenowych Paenibacillus larvae (dawniej Bacillus larvae) – powodujące zgnilca złośliwego czerwiu pszczół, i Bacillus alvei – powodujące kiślicę pszczół, jak również zarodniki grzybów pleśniowych Ascosfera apis – będące przyczyną grzybicy otorbielakowej pszczół (6).
Krajowe wymagania mikrobiologiczne dla pyłku kwiatowego zostały sprecyzowane w 2003 r. (7). Zostały one przedstawione w tabeli 1.
Tabela 1. Krajowe wymagania mikrobiologiczne dla pyłku kwiatowego (wg 7).
| Drobnoustroje | Dopuszczalna liczba lub obecność |
Drobnoustroje tlenowe mezofilne (1 g)
Grzyby pleśniowe i drożdżoidalne (1 g)
Bakterie z grupy coli (0,1 g)
Salmonella (25 g)
Staphylococcus aureus (1 g)
Bacillus cereus (1 g) |
< 10,00
< 500
0
0
< 10
< 10
|
Z przeglądu dostępnych materiałów wynika, że stopień zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami w świetle wymagań krajowych jest stosunkowo wysoki. Z badań Serra-Bonvechi i Escola-Jorda (3) wynika, że liczba próbek pyłku kwiatowego nieodpowiadająca tym wymaganiom wynosi 95%, z badań Kędzi i Hołdernej-Kędzi (8) wynika, że takich próbek jest 44,4%, natomiast badania Gonzalesa i wsp. (4) wskazują, że liczba próbek pyłku kwiatowego nieodpowiadających wymaganiom mikrobiologicznym (grzyby pleśniowe i drożdżoidalne) wynosi 71,4%. Wyniki przytoczonych badań zebrano w tabeli 2.
Tabela 2. Stopień zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami w świetle wymagań krajowych (wg 3, 4 i 8).
| Drobnoustroje | Serra-Bonvechi i Escola-Jorda (3) | Kędzia i Hołderna-Kędzia (8) | Gonzalez i wsp. (4) |
| (n=20) | (n=18) | (n=7) |
Drobnoustroje tlenowe (1 g)
Grzyby (1 g)
Bakterie coli (0,1 g)
Salmonella (25 g)
S. aureus
(1 g)
B. cereus (1 g) | 1*
19
11
| 3
5
6
0
0
1 |
5
|
| Liczba próbek pyłku kwiatowego nieodpowiadających wymaganiom | 19/20 | 8/18 | 5/7 |
| (95%) | (44,4%) | (71,4%) |
| *Liczba próbek nieodpowiadających wymaganiom |
Na podstawie przedstawionych powyżej wyników można przyjąć, że dla uzyskania próbek pyłku kwiatowego o czystości mikrobiologicznej odpowiadającej wymaganiom normatywnym, należy w większości przypadków dokonywać dekontaminacji mikrobiologicznej.
Celem podjętych badań była próba otrzymania pyłku kwiatowego o wysokiej czystości mikrobiologicznej oraz niezmienionej aktywności antybiotycznej i zawartości głównych składników biologicznie aktywnych.
Materiał i metody
Badane próbki
Pochodzenie i rok pozyskania próbek pyłku kwiatowego podano w tabeli 3. Badania próbek przeprowadzono w latach 1999-2000.
Tabela 3. Pochodzenie i rok pozyskania próbek pyłku kwiatowego użytych w badaniach.
| Numer próbki | Pochodzenie | Rok pozyskania próbki |
|
1
2
3
4
5
| Bartpol s.c., Poznań
Okręgowa Spółdzielania Pszczelarska, Poznań
Pasieka Specjalistyczna J. Ślachetka, Poznań
Sądecki Bartnik, Stróże
Apipol-Farma, Sp. z o.o., Myślenice |
1997
1999
1999
1999
1998
|
Proces dekontaminacji
Badania prowadzono w Stacji Radiacyjnego Utrwalania Płodów Rolnych we Włochach pod Warszawą. Próbki pyłku kwiatowego umieszczano w torebkach z folii polietylenowej w warstwie o grubości 1 cm. Próbki pyłku kwiatowego poddawano działaniu strumienia elektronów wytwarzanego przez akcelerator liniowy Pilot produkcji rosyjskiej. Energia elektronów (e–) wynosiła 8-10 MeV przy średniej mocy wiązki 1 kW. Zastosowano dawkę napromieniowania w wysokości 10 kGy.
Badania mikrobiologiczne
Badania dotyczące jakości mikrobiologicznej pyłku kwiatowego prowadzono według metodyki opracowanej przez Kędzię (1). Obejmowały one określanie ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych mezofilnych i grzybów pleśniowych i drożdżoidalnych oraz wykrywanie obecności bakterii z grupy coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus i bakterii beztlenowych Clostridium.
Oznaczanie aktywności antybiotycznej pyłku kwiatowego wykonywano w 10% wyciągach etanolowych sporządzonych z tego surowca. Próbki pyłku kwiatowego ekstrahowano 70% etanolem w stosunku 1:10 w warunkach pokojowych przez 3 dni, a następnie uzyskane wyciągi zagęszczano do objętości 65% suchej masy w wyparce próżniowej w temp. nie przekraczającej 40°C. Aktywność antybiotyczną oznaczano wcześniej opracowaną metodą z użyciem szczepu standardowego Staphylococcus aureus ATCC 6538P (9). Aktywność wyrażano w U/g zagęszczonego wyciągu.
Oznaczenia chemiczne
Zawartość flawonoidów oznaczano w zagęszczonych wyciągach etanolowych z pyłku kwiatowego metodą spektrofotometryczną podaną przez FP VI (10). Wyniki badań przeliczano na kwercetynę.
Zawartość kwasów tłuszczowych we frakcji lipidowej pyłku kwiatowego oznaczano według Metcalfa i wsp. (11). Frakcję lipidową ekstrahowano z próbek pyłku za pomocą mieszaniny chloroformu i metanolu (2:1). Następnie kwasy tłuszczowe estryfikowano mieszaniną BF3 w metanolu i estry metylowe kwasów po hydrolizie 0,5 n NaOH analizowano za pomocą chromatografii gazowej.
Wyniki i dyskusja
Wyniki badań przedstawione w tabeli 4 wskazują, że napromieniowanie próbek pyłku kwiatowego energią jonizującą w dawce 10 kGy obniża liczbę bakterii tlenowych średnio z 34.600 do 26 w 1 g, tj. o 99,925%. Z teoretycznego punktu widzenia można przyjąć, że na 1.000.000 drobnoustrojów przed dekontaminacją mikrobiologiczną po przeprowadzeniu tego procesu pozostaje w pyłku kwiatowym zaledwie 750 drobnoustrojów. Podobnie sytuacja kształtowała się w przypadku grzybów. Po procesie dekontaminacji ich liczba w pyłku kwiatowym obniżyła się średnio z 2.200 do 5 w 1 g (o 99,773%). Po dekontaminacji w pyłku kwiatowym nie stwierdzono ponadto bakterii z grupy coli oraz bakterii beztlenowych Clostridium. Wskazuje to na wysoką sprawność procesu dekontaminacji i możliwość uzyskiwania dzięki niej wysokiej czystości mikrobiologicznej pyłku kwiatowego, który po tym procesie odpowiadał we wszystkich przypadkach krajowym wymaganiom mikrobiologicznym.
Tabela 4. Wpływ procesu dekontaminacji mikrobiologicznej na stopień zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami.
| Drobnoustroje | Liczba lub obecność drobnoustrojów w próbce |
| przed dekontaminacją | po dekontaminacji |
Bakterie tlenowe mezofilne (1 g)
Grzyby pleśniowe i drożdżoidalne (1 g)
Bakterie z grupy coli (0,1 g)
Salmonella (25 g)
Staphylococcus aureus (1 g)
Bacillus cereus
Bakterie beztlenowe
Clostridium (0,1 g) | 34.600*
2.200
6
0/5
< 10
< 10
3/5 | 26
5
0
0/5
< 10
< 10
0/5 |
| *Średnia z 5 próbek |
Stwierdzono, że dekontaminacja mikrobiologiczna przy użyciu energii jonizującej nie wpływała w zasadniczy sposób na aktywność antybiotyczną badanych próbek pyłku kwiatowego (tab. 5). O ile średnia aktywność antybiotyczna tego produktu przed procesem wynosiła 300 U/g, to po napromieniowaniu wynosiła ona 320 U/g, a zatem po dekontaminacji nawet nieco wzrosła (o 6,7%).
Tabela 5. Wpływ procesu dekontaminacji mikrobiologicznej na aktywność antybiotyczną pyłku kwiatowego.
| Numer próbki | Aktywność antybiotyczna (U/g) |
| przed dekontaminacją | po dekontaminacji |
1
2
3
4
5 | 285
400
250
285
285 | 330
400
220
330
330 |
| Średnia |
300
|
320
|
Proces dekontaminacji mikrobiologicznej pyłku kwiatowego spowodował także niewielki wzrost zawartości związków flawonoidowych (średnio o 2,4%) (tab. 6). Jednocześnie zawartość kwasów tłuszczowych, w tym NNKT, obniżyła się średnio o 12,4% (tab. 7).
Tabela 6. Wpływ procesu dekontaminacji mikrobiologicznej na zawartość flawonoidów w pyłku kwiatowym.
| Numer próbki | Zawartość flawonoidów (mg/100 g) |
| przed dekontaminacją | po dekontaminacji |
1
2
3
4
5 | 210
250
280
290
210 | 220
260
280
290
220 |
| Średnia | 248 | 254 |
| *Wyniki przeliczano na kwercetynę |
Tabela 7. Wpływ procesu dekontaminacji mikrobiologicznej na zawartość kwasów tłuszczowych w pyłku kwiatowym.
| Kwasy tłuszczowe | Zawartość we frakcji lipidowej (%) |
| przed dekontaminacją | po dekontaminacji |
Kwas palmitynowy
Kwas stearynowy
Kwas oleinowy
Kwas linolowy*
Kwas a-linolenowy* | 20,9
0,9
1,3
6,5
25,4 | 17,9
0,6
1,1
5,4
23,2 |
| Razem | 55,0 | 48,2 |
| Procent | 100,0 | 87,6 |
| *Niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe (NNKT) |
W związku z powyższym można przyjąć, że dekontaminacja mikrobiologiczna pyłku kwiatowego przy użyciu energii jonizującej pozwala na otrzymanie produktu o wysokiej czystości mikrobiologicznej oraz praktycznie o niezmienionej aktywności antybiotycznej, a także zawartości flawonoidów i kwasów tłuszczowych jako substancji biologicznie aktywnych. Świadczy to o zachowaniu przez pyłek kwiatowy jego wartości terapeutycznych.
Badania nad dekontaminacją mikrobiologiczną pyłku kwiatowego prowadzone były już wcześniej. Joern (12) opatentował w 1992 r. sposób dekontaminacji mikrobiologicznej tego produktu za pomocą ozonu. Próbki pyłku kwiatowego poddawane były działaniu ozonu w stężeniu 100-130 mg/l, w środowisku kwaśnym przy wilgotności surowca 5-18%, w temp. 3-30°C w czasie 1-7 godz. Efekty działania ozonu na drobnoustroje obecne w pyłku kwiatowym nie zostały podane.
Kolejne badania, wykonane przez Yook i wsp. (13) w 1998 r. wykazały, że ozon zastosowany w stężeniu wielokrotnie mniejszym (18 mg/l) powodował w trakcie dekontaminacji mikrobiologicznej obniżenie w pyłku kwiatowym zawartości kwasów: oleinowego, linolowego i α-linolenowego o 67,8% oraz wyraźne zmiany jego zabarwienia (utrata barwników karotenoidowych), przy stosunkowo niewielkim obniżeniu liczby bakterii tlenowych (z 72.000 do 1.000 w 1 g) i grzybów drożdżoidalnych (z 12.000 do 950 w 1 g) (tab. 8).
Tabela 8. Dekontaminacja mikrobiologiczna pyłku kwiatowego przy użyciu ozonu i promieniowania jonizującego (wg 13).
| Sposób dekontaminacji | Liczba drobnoustrojów w 1 g próbki |
| ogólna liczba bakterii | grzyby pleśniowe | grzyby drożdżoidalne | pałeczki coli |
| Przed dekontaminacją | 72.000 | 230 | 12.000 | 0 |
| Ozon (18 mg/l) | 1.000 | 0 | 950 | 0 |
Promieniowanie jonizujące
2,5 kGy
5,0 kGy
7,5 kGy
10,0 kGy |
590
65
0
0 |
0
0
0
0 |
2.700
380
0
0 |
0
0
0
0 |
Yook i wsp. (13) znacznie lepsze wyniki otrzymali przy użyciu do dekontaminacji pyłku kwiatowego promieniowania jonizującego (tab. 8). Wysoki stopień czystości mikrobiologicznej pyłku kwiatowego osiągnięto już przy dawce promieniowania w wysokości 5,0 kGy. Natomiast wyższe dawki promieniowania (7,5 i 10,0 kGy) powodowały całkowite wyjałowienie tego produktu. Ponadto badania analityczne wykazały, że po dekontaminacji mikrobiologicznej pyłku kwiatowego energią jonizującą w dawce 5,0 kGy zawartość kwasu oleinowego, linolowego i α-linolenowego obniżyła się tylko o 1,1%, a przy dawce 10 kGy o 1,2% w odniesieniu do produktu niepoddawanego procesowi dekontaminacji. W niewielkim stopniu promieniowanie jonizujące w dawkach 5,0 i 10,0 kGy wpływało także na zabarwienie pyłku.
Wnioski
1. Napromieniowanie pyłku kwiatowego przy użyciu energii jonizującej w dawce 10 kGy w wysokim stopniu obniża poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych oraz praktycznie nie powoduje obniżenia aktywności biologicznej tego produktu pszczelego.
2. Przeprowadzone badania wskazują, że zastosowanie energii jonizującej pozwala na otrzymanie pyłku kwiatowego o wysokiej czystości mikrobiologicznej i zachowanie jego wartości terapeutycznej.
**Praca prezentowana częściowo na XXXVII Naukowej Konferencji Pszczelarskiej w Puławach w 2000 r.
Piśmiennictwo
1. Kędzia B. Badania nad zanieczyszczeniem surowców zielarskich drobnoustrojami. Rozprawa habilitacyjna. Wyd. IRiPZ, Poznań 1999; 44-50. 2. Makowicz J. Pierzga i pyłek kwiatowy. Wyd. Wyższej Szkoły Pedagogicznej, Kielce 1985; 22-5. 3. Serra-Bonvechi J, Escola-Jorda. Nutrient composition and microbiological quality of honeybee collected pollen in Spain. J Agric Food Chem 1997; 45:725-32. 4. Gonzalez G, Hinojo MJ, Matco R i wsp. Occurrence of mycotoxin producing fungi in bee pollen. Int J Food Microbiol 2005; 105:1-9. 5. Gliński Z, Jarosz J. Mikroflora pszczoły miodnej. Post Mikrobiol 1988, 27:95-107. 6. Kostecki R, Tomaszewska B. Choroby i szkodniki pszczół. PWRiL. Warszawa 1987. 7. Dziennik Ustaw Nr 37 z dn. 13 stycznia 2003, poz. 326. Rozporządzenie w sprawie maksymalnych poziomów zanieczyszczeń chemicznych i biologicznych w żywności. 8. Hołderna-Kędzia E, Kędzia B. Badania w ramach tematu 125 – Badania dla zleceniodawców zewnętrznych. Inst. Włókien Nat i Rośl Ziel, Poznań 2000-2010. Dane nieopublikowane. 9. Hołderna-Kędzia E, Kędzia B, Mścisz A. Poszukiwanie wyciągów roślinnych o wysokiej aktywności antybiotycznej. Post Fitoter 2009; (1):3-11. 10. Farmakopea Polska VI. Oznaczanie zawartości flawonoidów. Wyd Min Zdr, Warszawa 2002; 150. 11. Metcalf LD, Schmitz AA, Pelka JR. Rapid preparation of fatty acid esters from lipids for gas chromatographic analysis. Anal Chem 1966; 38:514-5. 12. Joern KE. Sterilization of plant materials such as pollen or seeds. Ger Offen DE 3, 541, 706. Med Arom Plants Abstr 1992; 14(2):216. 13. Yook H-S, Lim S-I, Byun M-W. Changes in microbiological and physicochemical properties of bee pollen by application of gamma irradiation and ozone treatment. J Food Prot 1998: 61(2):217-220.
otrzymano/received: 2010-06-17
zaakceptowano/accepted: 2010-08-20
Adres/address:
*Bogdan Kędzia
Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich
Oddział Roślin Zielarskich
ul. Libelta 27, 61-707 Poznań
tel.: (61) 665-95-40, fax: (61) 665-95-51
e-mail: bogdan.kedzia@iwnirz.pl
