Postępy Fitoterapii - Wydawnictwo Medyczne Borgis - Analiza fitochemiczna korzeni hakorośli rozesłanej (<i> Harpagophytum procumbens </i>DC.)

*Tadeusz Wolski, Tomasz Baj, Agnieszka Ludwiczuk, Kazimierz Głowniak, Radosław Niedźwiecki

Analiza fitochemiczna korzeni hakorośli rozesłanej ( Harpagophytum procumbens DC.)

Phytochemical analysis of roots of devil's claw (Harpagophytum procumbens DC.)

Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Kierownik Katedry: prof. dr hab. Kazimierz Głowniak

Summary
In the present paper the phytochemical analysis of Devil's Claw (Harpagophytum procumbens DC.) roots concerning analysis of iridoid derivatives, flavonoids, phenolic acids and tannins was described. The content of the major active compound, harpagoside, in the plant material and pharmaceutical preparation named Pagosid, was determined. Quantitative analysis was performed by use of spectrophotometric, TLC and HPLC methods. The content of harpagoside in Harpagophyti radix amounted 1.25% (determined by spectrophotometric method), 1.29% (TLC) and 2.17% (HPLC), while in tablets Pagosid 0.77%, 0.99% and 0.87%, respectively. These data indicated that Devil's Claw roots meet the requirements of European Pharmacopoeia (not less than 1.2% of harpagoside) and DAB 10 (not less than 1%). The content of harpagoside in Pagosid was below both pharmacopoeias requirements. Qualitative analysis of the flavonoids did not show the presence of free aglycones in plant material, while the presence of luteolin, kaempherol and flavone glycosides was confirmed. The total content of flavonoids in Harpagophyti radix recalculated into quercetin was 0.01%. Analysis of phenolic acids showed the presence of cinnamic, ferulic, p-coumaric, chlorogenic, caffeic and protocatechuic acids. Additionally, gallic acid was identified in the fraction received after hydrolysis of Devil's Claw roots. The content of tannins in the investigated raw material amounted 5.53% recalculated into dry matter. Qualitative analysis of this group of compounds showed the absence of catechin derivatives, while the presence of gallotannins and caffeic acid derivatives was confirmed. It is worthy of mention that spectrophotometric determination of the harpagoside content using Godin reagent at 540 nm have been applied for the first time. Described method can be used for screening determination of the content of harpagoside in plant material and pharmaceutical preparations.

Key words: harpagophyti radix, flavonoids, phenolic acids, tannins, godin reagent

W poprzedniej pracy (1) przedstawiono przegląd piśmiennictwa dotyczącego hakorośli rozesłanej Harpagophytum procumbens DC. oraz opisano wygląd anatomiczno-morfologiczny surowca, a także omówiono skład fitochemiczny. Do głównych związków biologicznie aktywnych występujących w badanym surowcu należą irydoidy właściwe typu aukubiny, tj. harpagozyd (0,1-3%) oraz produkty jego rozpadu: 8-p-kumaroiloharpagid i harpagid. Ponadto występują: prokumbid i jego 6' p -kumarylowy ester, a także prokumbozyd. Ta grupa związków decyduje o wielokierunkowym działaniu farmakologicznym hakorośli. Surowiec ten zyskuje na znaczeniu i zastosowaniu w fitoterapii, czego dowodem jest prezentowana monografia w ostatniej edycji ESCOP (2).

Celem niniejszej pracy było wykonanie badań nad składem chemicznym korzeni hakorośli rozesłanej z gatunku Harpagophytum procumbens DC., należącej do rodziny Połapkowatych (Pedaliaceae). Badania te obejmowały analizę wstępną surowca, a więc oznaczenie suchej masy, składników mineralnych (popiołu), a także izolację, identyfikację i oznaczenie ilościowe głównych grup związków biologicznie aktywnych obecnych w surowcu: pochodnych irydoidów, flawonoidów, fenolokwasów i garbników. Ponadto przeprowadzono analizę zawartości głównego składnika czynnego – harpagozydu w badanym surowcu oraz preparacie Pagosid zawierającym wyciąg z korzenia Harpagophytum.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły drugorzędowe korzenie (bulwy) hakorośli rozesłanej – Harpagophyti radix oraz preparat handlowy Pagosid firmy Dr Dünner (Szwajcaria). Badane surowce pochodziły z 2001 roku.

Metodyka badań

Analiza wstępna badanego surowca

Analiza wstępna obejmowała oznaczenie straty masy po suszeniu oraz zawartości substancji mineralnych (popiołu) w korzeniu Harpagophytum procumbens DC. Analizy te prowadzono zgodnie z FP V (3), a uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Procentowa zawartość wilgoci i popiołu w korzeniu hakorośli rozesłanej ( Harpagophytum procumbens DC.).

Nr próby	Wilgotność (% wag.)	Popiół (% wag.)
1 2 3	10,48 10,42 10,49	5,56 5,50 5,32
Średnia	10,46	5,46

Analiza fitochemiczna badanego surowca i preparatu Pagosid

Przygotowanie ekstraktów do badań

Odważono 2,0 g rozdrobnionego surowca i przeniesiono do kolby okrągłodennej. Surowiec traktowano 20 ml metanolu i ogrzewano przez 30 min na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną. Wyciąg przesączono przez watę do kolby miarowej o poj. 50 ml. Ekstrakcję wykonano ponownie, wyciągi połączono i uzupełniono metanolem do kreski. Wyciągi poddano dalszym analizom.

Ekstrakcję tabletek Pagosid przeprowadzono tą samą metodą, a do oznaczenia użyto jednej tabletki (1 tabl. odpowiada 820 mg korzenia Harpagophytum).

Wstępna analiza ekstraktu metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

Analizę TLC prowadzono na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄. Chromatogramy rozwijano w układzie: 1-propanol:toluen:kwas octowy:woda (5:4:2:2 v/v).

Po rozwinięciu i wysuszeniu chromatogramy umieszczano pod lampa UV (λ=254 nm). Następnie płytki wywołano przez spryskanie odczynnikami:

– odczynnikiem Godina (A: 1% etanolowy roztwór waniliny, B: 5% etanolowy roztwór H₂SO₄),

– odczynnikiem EP (0,25 g aldehydu 4,4-dimetyloaminobenzoesowego rozpuszczono w mieszaninie 45 ml kwasu octowego lodowatego, 5 ml kwasu fosforowego 85% i 45 ml wody), całość ogrzewano 3-5 minut w temperaturze 100°C.

Wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

Tabela 2. Wartosci R_F i barwy plam widocznych na chromatogramie pod lampą UV (λ=254 nm) i po spryskaniu odczynnikiem EP.

Przedmiot badania	Plama	Barwa plamy w świetle UV (l=254 nm)	Barwa plamy po spryskaniu odczynnikiem EP	RF
Wzorzec harpagozydu	1	brunatna	jasnoniebieska	0,61
Ekstrakt z surowca	IA IB IC ID IE	ciemnożółta ciemnożółta ciemnożółta ciemnożółta brunatnoniebieska	biała biała biała biała jasnoniebieska	0,20 0,24 0,41 0,50 0,62
Ekstrakt z tabletek Pagosid	IIA IIB IIC IID IIE	ciemnożółta ciemnożółta ciemnożółta ciemnożółta brunatnoniebieska	biała biała biała biała jasnoniebieska	0,20 0,26 0,42 0,50 0,61

Tabela 3. Wartosci R_F i barwy plam na chromatogramie po spryskaniu odczynnikiem Godina.

Przedmiot badania	Plama	Barwa plamy po spryskaniu odczynnikiem Godina	RF
Wzorzec harpagozydu	1	jasnoczerwona	0,61
Ekstrakt z surowca	IA IB IC ID IE	brunatna brunatna brunatna brunatna jasnoczerwona	0,20 0,24 0,39 0,48 0,62
Ekstrakt z tabletek Pagosid	IIA IIB IIC IID IIE	brunatna brunatna brunatna brunatna jasnoczerwona	0,20 0,25 0,40 0,49 0,61

Oznaczenia jakościowe i ilościowe harpagozydu

Metoda spektrofotometryczna

Wyznaczanie analitycznej długości fali

Na płytkę pokrytą żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ naniesiono 0,01 ml, 0,02 ml i 0,04 ml ekstraktu z surowca i 0,02 ml wzorca harpagozydu o stężeniu 0,02%. Płytkę rozwinieto w układzie: 1-propanol:toluen:kwas octowy:woda (5:4:2:2 v/v).

Pod lampą UV (λ=254 nm) obrysowano plamy harpagozydu i przeniesiono preparatywnie do próbówek wirówkowych, dodano 4 ml odczynnika Godina. Próbówki ogrzewano na łaźni wodnej przez 5 min. Następnie wirowano przez 10 min, po czym zmierzono absorbancję próbek w zakresie długości fali 400-630 nm, stosując jako odnośnik odczynnik Godina, wyznaczając w ten sposób maksimum absorbancji, która wynosiła 540 nm (ryc. 1).

Ryc. 1. Zależność absorbancji od długości fali dla barwnego połączenia harpagozydu z odczynnikiem Godina.

Wyznaczanie krzywej wzorcowej harpagozydu

Na płytkę TLC naniesiono 25, 50, 75, 100 i 125 μl roztworu wzorca harpagozydu (0,02%) odpowiadające 5, 10, 15, 20 i 25 μg harpagozydu. Płytkę rozwinięto, a plamy harpagozydu przeniesiono ilościowo do próbówek wirówkowych. Do każdej z probówek dodano po 4 ml odczynnika Godina i ogrzewano na łaźni wodnej przez 10 min. Następnie odwirowano żel krzemionkowy i zmierzono absorbancję przy długości fali λ=540 nm. Wyniki przedstawiono na rycinie 2.

Ryc. 2. Zależność absorbancji od stężenia dla barwnego połączenia harpagozydu z odczynnikiem Godina (λ=540 nm).

Oznaczanie zawartości

Badane ekstrakty nanoszono na płytki TLC w ilości po 50 μl w trzech powtórzeniach. Dalej postępowano jak przy wyznaczaniu analitycznej długości fali. Zawartość harpagozydu wyznaczono na podstawie krzywej wzorcowej. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4. Wartość absorbancji barwnego połączenia harpagozydu z odczynnikiem Godina w badanym surowcu i w tabletkach Pagosid.

Przedmiot badania	Numer próbki	Absorbancja	Średnia
Surowiec	1 2 3	0,118 0,112 0,114	0,115
Tabletki	1 2 3	0,066 0,062 0,065	0,064

Metoda TLC

Przy pomocy automatycznego urządzenia do nanoszenia próbek Autosampler TLC III (Camag, Szwajcaria) naniesiono na płytkę pokrytą żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ po 10 μl ekstraktów z surowca i tabletek oraz 10, 20, 30, 40 i 50 μl wzorca o stężeniu 0,02%, co odpowiada 2, 4, 6, 8 i 10 μg harpagozydu. Płytkę rozwinęto na dystansie 15 cm w układzie: 1-propanol:toluen:kwas octowy:woda (5:4:2:2 v/v).

Następnie wykonano zdjęcie płytki w świetle UV (λ=254 nm) używając do tego celu VideoScanera TLC/HPTLC firmy Camag (Szwajcaria). Wykonane zdjęcie poddano obróbce przy pomocy programu VideoStore, otrzymując chromatogramy TLC dla ekstraktów z surowca i tabletek oraz wzorca o wyżej podanych stężeniach. Zawartość harpagozydu wyliczono na podstawie krzywej wzorcowej f=S(c), gdzie S – pole powierzchni piku wzorca; c – steżęnie wzorca (ryc. 3 i 4).

Ryc. 3. Chromatogram TLC wzorca harpagozydu o różnych stężeniach oraz wyciągu z surowca i tabletek Pagosid otrzymany w warunkach: Si-60 G F₂₅₄/1-propanol:toluen:kwas octowy:woda (5:4:2:2 v/v); λ=254 nm.

Ryc. 4. Zależność pola powierzchni piku od stężenia harpagozydu F=S(c).

Metoda HPLC

Analizę przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną w Farmakopei Europejskiej (3. edycja) (4).

Przygotowanie wzorca: 2 mg harpagozydu rozpuszczono w 5 ml metanolu. Roztwór przeniesiono ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10 ml i uzupełniono do kreski metanolem.

Standard wewnętrzny: 0,130 g cynamonianu metylu rozpuszczono w 50 ml metanolu i uzupełniono do 100 ml metanolem.

Przygotowanie próbki: Do 0,5 g sproszkowanego surowca dodano 50 ml metanolu. Wytrząsano 1 godz., następnie prząsaczono. Sączek wraz z pozostałością przeniesiono do kolby o poj. 100 ml, dodano 50 ml metanolu i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 1 godz., następnie ochłodzono i przesączono. Kolbę i sączek przemyto dwukrotnie po 5 ml metanolu. Filtraty i roztwory po przemyciu kolby i sączka połączono i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze nieprzekraczającej 40°C. Pozostałość ekstrahowano trzykrotnie porcjami po 5 ml metanolu i przesączono do kolbki na 25 ml. Po przemyciu sączka uzupełniono kolbę do kreski metanolem. Do 10 ml tego roztworu dodano 1 ml standardu wewnętrznego i rozcieńczono otrzymany roztwór do 25 ml metanolem. Identyczną procedurę zastosowano w przypadku preparatu Pagosid.

Analizę HPLC prowadzono stosując chromatograf typu LaChrom-Merck z detektorem diodowym DAD L-7450, pompą HPLC L-7100, dozownikiem Rheodyne, pętlą dozującą 10 μl, kolumną LiChrospher 100 RP-C₁₈ o wymiarach 250 mm x 4 mm i średnicy ziaren 5 μm. Fazą ruchomą był metanol:woda (60:40 v/v), szybkość przepływu wynosiła 0,8 ml/min. Zawartość harpagozydu wyliczono według wzoru:

X = (m₂ x F₁ x 7,622)/(F₂ x m₁);

gdzie:

m₁ – masa odważki (g),

m₂ – masa cynamonianu metylu zawartego w 100 ml standardu wewnętrznego (g),

F₁ – powierzchnia pod pikiem harpagozydu,

F₂ – powierzchnia pod pikiem cynamonianu metylu.

Chromatogramy HPLC, będące efektem oznaczenia ilościowego harpagozydu, przedstawione są na rycinach 5-7, zaś porównawcze wyniki oznaczenia tego związku trzema metodami podane są w tabeli 5 oraz rycinie 8.

Ryc. 5. Chromatogram HPLC wzorca harpagozydu.

Ryc. 6. Chromatogram HPLC wyciągu z Harpagophyti radix z dodatkiem wzorca wewnętrznego.

Ryc. 7. Chromatogram HPLC wyciągu z tabletek Pagosid z dodatkiem wzorca wewnętrznego.

Tabela 5. Zawartość procentowa harpagozydu w wyciągach z korzenia i tabletek Pagosid oznaczona trzema metodami: spektrofotometryczną, TLC i HPLC.

Przedmiot badań	Zawartość (%)			Zawartość (%) w przeliczeniu na suchą masę
Przedmiot badań	A	B	C	A	B	C
Surowiec	1,132	1,165	1,964	1,250	1,287	2,169
Tabletki	0,765	0,991	0,866	0,845	1,095	0,975
A - Metoda spektrofotometryczna; B - Metoda densytometryczna; C - Metoda HPLC

Ryc. 8. Wykres zależności zawartości harpagozydu w surowcu i tabletkach Pagosid od metody oznaczenia.
A – metoda spektrofotometryczna; B – metoda densytometryczna; C – metoda HPLC

Analiza flawonoidów

Oznaczanie ogólnej zawartości flawonoidów w surowcu

Oznaczenie przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną w FP V (3). Do analizy odważano dokładnie 1,0 g badanego surowca. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

Tabela 6. Zawartość procentowa flawonoidów w Harpagophyti radix w przeliczeniu na kwercetynę.

Numer próby	Absorbancja	Zawartość flawonoidów (%)	Zawartość flawonoidów w przeliczeniu na suchą masę
1 2 3	0,010 0,009 0,011	0,00875 0,007875 0,009625	0,0098 0,0088 0,0107
Średnia	0,0095	0,00875	0,0098

Analiza TLC flawonoidów

50,0 g rozdrobnionego korzenia hakorośli rozesłanej ekstrahowano eterem naftowym w aparacie Soxhleta w czasie około 10 godz. Surowiec pozbawiony ciał balastowych wysuszono, a następnie ekstrahowano metanolem. Ekstrakt metanolowy zagęszczono na wyparce obrotowej. Następnie wytrawiono niewielką ilością gorącej wody, pozostawiono na 24 godz. w lodówce, po czym przesączono. Ekstrakt wodny ekstrahowano octanem etylu, osuszono bezwodnym siarczanem sodu i przeprowadzono analizę TLC wobec wzorców na płytkach pokrytych poliamidem w układzie metanol:woda:kwas octowy (20:12,5:1 v/v) oraz na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ w układzie:toluen:mrówczan etylu:kwas mrówkowy (5:4:1 v/v).

Po rozwinięciu i wysuszeniu chromatogramy umieszczono pod lampą UV (λ=365 i 254 nm). Po czym spryskano płytki 5% metanolowym roztworem chlorku glinu.

Badaniom TLC poddano również ekstrakt otrzymany według procedury zastosowanej do oznaczenia ogólnej zawartości flawonoidów w surowcu. Ekstrakt ten odparowano do sucha, rozpuszczono w niewielkiej ilości metanolu i przesączono. Otrzymany roztwór nanoszono na płytki pokryte żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ wobec wzorców i rozwijano w układzie toluen:mrówczan etylu:kwas mrówkowy (5:4:1 v/v).

Po rozwinięciu i wysuszeniu chromatogramy umieszczono pod lampą UV (λ=254 nm) i zaznaczono plamy flawonoidów. Następnie, w celu oczyszczenia frakcji, żel wraz z plamami przenoszono do próbówek i ekstrahowano metanolem. Roztwory frakcjonowanych flawonoidów wraz z wzorcami nanoszono na płytkę i przeprowadzono analizę TLC analogiczną do wyżej opisanej.

Po rozwinięciu i wysuszeniu chromatogram umieszczono pod lampą UV (λ=254 nm) i wykonano zdjęcie za pomocą VideoScanu firmy CAMAG. Wartości R_f flawonoidów przedstawiono w tabeli 7.

Tabela 7. Wartości współczynników R_f dla poszczególnych plam flawonoidów obecnych na chromatogramie TLC.

Przedmiot badania	Plama	Rf
Flawon wzorzec Surowiec Luteolina wzorzec Surowiec Kemferol wzorzec Surowiec	1 Ia 2 IIa IIb IIc 3 IIIa IIIb	0,68 0,67 0,45 0,39 0,45 0,47 0,55 0,55 0,57

Analiza fenolokwasów

Izolacja zespołu wolnych fenolokwasów

50,0 g korzenia hakorośli rozesłanej ekstrahowano eterem naftowym w aparacie Soxhleta przez około 10 godz. Następnie gilzy osuszono i przeprowadzono dalszą ekstrakcję metanolem. Ekstrakt metanolowy zagęszczono przez odparowanie rozpuszczalnika na wyparce obrotowej, a pozostałość wytrawiono gorącą wodą i pozostawiono w lodówce na dobę. Otrzymany ekstrakt wodny przesączono i ekstrahowano 10-krotnie eterem etylowym w porcjach po 50 ml. Ekstrakt eterowy zagęszczono i wytrząsano z 20 ml 5% roztworu wodorowęglanu sodowego. Warstwę wodno-węglanową zakwaszono kwasem solnym do pH=3 i ponownie ekstrahowano eterem etylowym (10 x 20 ml). Ekstrakt eterowy osuszono bezwodnym siarczanem sodowym i przesączono. Rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w 10 ml metanolu.

Izolacja zespołu fenolokwasów po hydrolizie surowca

Odważono 2,0 g rozdrobnionego surowca i umieszczono w kolbie okrągłodennej. Próbkę zalano 50 ml 4% roztworu kwasu siarkowego i umieszczono na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną. Po 3 godz. wyciąg przesączono i ekstrahowano 10-krotnie eterem etylowym w porcjach po 10 ml. Wyciąg eterowy osuszono bezwodnym siarczanem sodowym i przesączono. Rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w 10 ml metanolu.

Analiza TLC

Analizie TLC poddano zarówno ekstrakt zawierający wolne fenolokwasy, jak i roztwór fenolokwasów po hydrolizie.

Wyciągi oraz wzorce naniesiono na płytkę TLC pokrytą żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ i rowijano w układzie: toluen:mrówczan etylu:kwas mrówkowy (5:4:1 v/v).

Po rozwinięciu i wysuszeniu chromatogram umieszczono pod lampą UV (λ=254 nm) i wykonano zdjęcie za pomocą VideoScanu Firmy CAMAG. Następnie płytki spryskano 1% metanolowym roztworem chlorku żelazowego i wykonano zdjęcie w swietle widzialnym. Wyniki przedstawiono na rycinach 9 i 10 oraz w tabeli 8.

Ryc. 9. Chromatogram TLC fenolokwasów obecnych w Harpagophyti radix po wywołaniu w świetle UV (λ=254 nm).

Ryc. 10. Chromatogram TLC fenolokwasów obecnych w Harpagophyti radix po wywołaniu 1% metanolowym roztworem FeCl₃.

Tabela 8. Wartości współczynników R_F dla poszczególnych plam fenolokwasów obecnych na chromatogramach przedstawionych na rycinach 9 i 10.

Roztwór naniesiony	Plama	RF
Kwas kawowy Kwas cynamonowy Ekstrakt z surowca zawierający frakcję wolnych fenolokwasów Ekstrakt z surowca zawierający frakcję fenolokwasów po hydrolizie 4% H2SO4 Kwas ferulowy Kwas chlorogenowy Kwas galusowy	1 2 Ia Ib Ic Id Ie IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg 3 4 5	0,51 0,68 0,09 0,51 0,53 0,56 0,68 0,13 0,31 0,40 0,43 0,51 0,56 0,68 0,56 0,04 0,40

Wykonano również analizę TLC fenolokwasów na płytkach pokrytych celulozą w układzie rozwijającym: woda:dioksan (10:1 v/v). Po rozwinięciu i wysuszeniu płytki wywołano przez spryskanie 1% metanolowym roztworem FeCl₃. Wyniki podaje tabela 9.

Tabela 9. Wyniki analizy TLC fenolokwasów na płytkach pokrytych celulozą w układzie rozwijającym: woda:dioksan (10:1 v/v) po wywołaniu 1% metanolowym roztworem FeCl₃.

Przedmiot badania	Plama	Barwa plamy po spryskaniu 1% FeCl3	RF
Kwas kawowy Kwas p-kumarowy Kwas chlorogenowy Fenolokwasy wolne Fenolokwasy po hydrolizie	1 3 4 Ia Ib Ic Id IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg	ciemnobrunatna pomarańczowo-brunatna zielono-brunatna ciemnobrunatna ciemnobrunatna ciemnobrunatna pomarańczowo-brunatna ciemnobrunatna jasnobrunatna niebiesko-brunatna ciemnobrunatna ciemnobrunatna zielono-brunatna pomarańczowo-brunatna	0,24 0,83 0,77 0,49 0,69 0,77 0,85 0,23 0,33 0,45 0,61 0,69 0,76 0,86

Metoda HPLC

Ekstrakty otrzymane zgodnie z procedurą opisaną w procesie izolacji zespołu fenolokwasów poddano analizie HPLC.

Analizę przeprowadzono stosując chromatograf typu LaChrom-Merck z detektorem diodowym DAD L-7450, pompą HPLC L-7100, pętlą dozującą 20 μl, dozownikiem Rheodyne, kolumną LiChrospher 100 RP-C₁₈ o wymiarach 250 mm x 4 mm i średnicy ziaren 5 μm. Faza ruchoma metanol + woda (25+75 v/v) z dodatkiem 1% v/v kwasu octowego; szybkość przepływu wynosiła 0,8 ml/min, a wielkość nastrzyku 20 μl. Identyfikację fenolokwasów przeprowadzono porównując ich czasy retencji (R_t) z wzorcami oraz spektroskopowo wyznacząjac ich widma DAD w zakresie długości fali 219-400 nm.

Wyniki przedstawiono na rycinach 11-12 oraz w tabelach 10 i 11.

Ryc. 11. Chromatogram HPLC wolnych fenolokwasów obecnych w Harpagophyti radix.

Ryc. 12. Chromatogram HPLC wolnych fenolokwasów otrzymanych po hydrolizie surowca.

Tabela 10. Wartości czasów retencji R_t dla wzorców kwasów fenolowych otrzymane w wyniku analizy HPLC.

Fenolokwas	Czas retencji Rt (min)
Kwas galusowy Kwas protokatechowy Kwas chlorogenowy Kwas p-hydroksybenzoesowy Kwas syryngowy Kwas wanilinowy Kwas kawowy Kwas p-kumarowy Kwas ferulowy	4,46 6,81 9,96 10,43 11,93 13,86 15,37 28,77 35,39

Tabela 11. Wyniki analizy HPLC wolnych fenolokwasów i fenolokwasów obecnych w ekstrakcie po hydrolizie surowca.

Przedmiot badania	R_t	Związek	Wsp. korelacji z widmem wzorca
Wyciąg z surowca zawierający wolne fenolokwasy	6,41 15,03 27,50 34,40	kw. protokatechowy kw. kawowy kw. p-kumarowy kw. ferulowy	0,9947 0,9955 1,0000 0,9997
Wyciąg z surowca zawierający fenolokwasy po hydrolizie 4% H₂SO₄	17,14 32,53 40,35	kw. kawowy kw. p-kumarowy kw. ferulowy	0,9998 0,9940 0,9915

Analiza garbników

Sporządzanie ekstraktu z surowca

Oznaczenie wykonano metodą miareczkowo-wagową opisaną w FP IV (5). Odważono 10,0 g korzenia hakorośli rozesłanej, zalano 500 ml wody i powoli ogrzano do wrzenia. Ostudzony ekstrakt wodny przesączono przez zwitek waty do kolby miarowej o pojemności 1000 ml, starając się, aby surowiec nie spłynął na watę. Surowiec zalano ponownie 300 ml wody, ogrzano do wrzenia i gotowano przez 10 min. Po ochłodzeniu ekstrakt przesączono przez watę do kolby miarowej i uzupełniono wodą do kreski. Otrzymany ekstrakt przesączono przez bibułę, odrzucając pierwsze 20 ml przesączu.

Oznaczanie ilościowe garbników w Harpagophyti radix

Do zlewki o pojemności 150 ml odmierzono dokładnie 50 ml ekstraktu oraz 25 ml 0,1 M roztworu octanu miedziowego i zamieszano dokładnie bagietką. Wytrącony osad garbnikanów miedzi po upływie 12 godz. odsączono na uprzednio wysuszonym i zważonym sączku o średnicy 11 cm. Przezroczysty przesącz odstawiono. Resztki osadu spłukano na ten sam sączek i osad przemyto wodą, aż do ujemnej reakcji na jony miedzi (1 ml przesączu po dodaniu 1 ml 5% roztworu żelazocyjanku potasowego nie powinien wykazywać brunatnego zabarwienia). Sączek z osadem wysuszono w temperaturze 100-102°C do stałego ciężaru. Z odstawionego przesączu, zawierającego niezwiązany octan miedziowy, odmierzono dokładnie 25 ml do kolby stożkowej o pojemności 200 ml, dodano 10 ml 10% kwasu siarkowego, 2 g jodku potasu rozpuszczonego w 5 ml wody i 2 ml roztworu skrobi. Tak przygotowaną próbkę miareczkowano 0,1 M roztworem tiosiarczanu sodowego do chwili zmiany zabarwienia z brunatnoniebieskiego na białe.

Obliczenie zawartości garbników:

Obliczenie zawartości garbników w 50 ml ekstraktu wodnego:

X = C - (a - 3b) x 6,354 x 1,2518

gdzie:

X – ilość garbników (w mg) w 50 ml wyciągu wodnego,

a – ilość ml ściśle 0,1 M roztworu octanu miedziowego użytego do oznaczenia,

b – ilość ml ściśle 0,1 M roztworu Na₂S₂O₃ użyta do zmiareczkowania miedzi niezwiązanej przez garbniki,

c – ciężar garbnikanów miedzi (w mg),

6,354 – ilość mg miedzi w 1 ml 0,1 M roztworu octanu miedziowego,

1,2518 – stosunek mas cząsteczkowych.

Obliczenie zawartości garbników w badanym surowcu (% wagowe):

Y = 2x/d

gdzie:

Y – zawartość garbników w badanym surowcu,

x – obliczona zawartość garbników (mg) w 50 ml wyciągu wodnego,

d – odważka surowca (g).

Wyniki ilościowego oznaczenia garbników przedstawiono w tabeli 12.

Tabela 12. Zawartość procentowa garbników w Harpagophyti radix wyznaczona według metody opisanej w FP IV (5).

Numer próby	Masa garbnikanów miedzi (mg)	Ilość ml ściśle 0,1N roztworu Na₂S₂O₃ użyta do zmiareczkowania miedzi nie związanej przez garbniki	Zawartość procentowa garbników w surowcu (%)	Zawartość procentowa garbników w surowcu w przeliczeniu na suchą masę (%)
I II III	20,5 21,9 21,1	8,5 8,45 8,5	4,90 4,94 5,02	5,47 5,51 5,60
Średnia zawartość garbników (%)			4,95	5,53

Analiza TLC

Odważono dwie próbki po 2,0 g rozdrobnionego surowca i przeniesiono do kolb okrągłodennych. Jedną z nich zalano wodą, a drugą 4% roztworem kwasu siarkowego. Kolby umieszczono we wrzącej łaźni wodnej pod chłodnicami zwrotnymi i ogrzewano przez 3 godz. Następnie ekstrakty przesączono przez zwitki waty do rozdzielaczy i ekstrahowano octanem etylu. Ekstrakty octanowe osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Suchą pozostałość rozpuszczono w niewielkiej ilości metanolu i przeprowadzono analizę TLC wobec wzorców na płytkach pokrytych poliamidem w układach rozwijających:

metanol:woda:kwas octowy (20:12,5:1 v/v),

metanol:woda:dioksan:kwas octowy (20:12:1:1 v/v),

na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ w układzie:

toluen: mrówczan etylu: kwas mrówkowy (5:4:1 v/v)

oraz na płytkach pokrytych celulozą w układach rozwijajacych:

woda:dioksan (5:1 v/v),

woda:dioksan (10:1 v/v).

Po rozwinięciu chromatogramy wysuszono, po czym wywołano przez spryskanie 1% metanolowym roztworem FeCl₃ oraz przez spryskanie odczynnikiem Godina. Wyniki analizy przedstawiono w tabelach 13 i 14.

Tabela 13. Wyniki analizy TLC związków garbnikowych prowadzonej na płytkach pokrytych celulozą w układzie rozwijającym: woda:dioksan (10:1 v/v) wywołanej 1% metanolowym roztworem FeCl₃.

Przedmiot badania		Plama	Barwa plamy po spryskaniu 1% FeCl₃	RF
Wzorce	kwas kawowy kwas galusowy kwas elagowy kwas chlorogenowy + katechina DL-katechina - epikatechina	1 2 3 4 5 6 7	ciemnobrunatna niebiesko-brunatna ciemnoniebieska zielono-brunatna jasnobrunatna jasnobrunatna jasnobrazowa	0,24 0,46 0,01 0,77 0,54 0,50 0,41
Badane ekstrakty	garbniki wolne	Ia Ib Ic Id	ciemnobrunatna ciemnobrunatna zielono-brunatna pomarańczowo-brunatna	0,50 0,69 0,78 0,87
Badane ekstrakty	garbniki po hydrolizie	IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg	ciemnobrunatna jasnobrunatna niebiesko-brunatna ciemnobrunatna ciemnobrunatna zielono-brunatna pomarańczowo-brunatna	0,23 0,34 0,45 0,62 0,70 0,76 0,86

Tabela 14. Wyniki analizy TLC związków garbnikowych prowadzonej na płytkach pokrytych celulozą w układzie rozwijającym: woda:dioksan (10:1 v/v) wywołanej odczynnikiem Godina.

Przedmiot badania		Plama	Barwa plamy po spryskaniu odczynnikiem Godina	RF
Wzorce	kwas kawowy kwas galusowy kwas elagowy kwas chlorogenowy + katechina DL-katechina - epikatechina	1 2 3 4 5 6 7	jasnobrunatna brunatno-bordowa ciemnobrunatna ciemnobrunatna czerwona czerwona czerwona	0,23 0,45 0,01 0,76 0,53 0,50 0,42
Badane ekstrakty	garbniki wolne	Ia Ib Ic Id	brunatna jasnobrunatna brunatna ciemnobrunatna	0,20 0,52 0,69 0,77
Badane ekstrakty	garbniki po hydrolizie	IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg	jasnobrunatna brunatna brunatno-bordowa brunatna ciemnobrunatna jasnoczerwona jasnobrunatna	0,23 0,32 0,44 0,60 0,76 0,82 0,84

Wyniki i omówienie

Dane dotyczące wilgotności i składników mineralnych w Harpagophyti radix przedstawia tabela 1.

Jak wynika z tabeli 1 zawartość wilgotności i popiołu w korzeniu Harpagophytum procumbens DC. wynosi średnio 10,46%, a zawartość popiołu średnio 5,46%. Otrzymane wyniki są zgodne z danymi Farmakopei Europejskiej, której wymagania dla badanego surowca są następujące: wilgotność – nie więcej niż 12,0%; popiół – nie więcej niż 8,0% (4).

Badanie TLC nad identyfikacją głównego składnika korzeni hakorośli rozesłanej i tabletek Pagosid – harpagozydu – prowadzono na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ w układzie: 1-propanol:toluen:kwas octowy:woda (5:4:2:2 v/v).

Chromatogramy po rozwinięciu oglądano pod lampą UV (λ=254 nm), a następnie wywoływano odczynnikami Godina i EP. Wyniki analizy przedstawiają tabele 2 i 3.

Wyniki przedstawione w tabelach 2 i 3 jednoznacznie wskazują na obecność harpagozydu w badanym surowcu i tabletkach. Świadczy o tym obecność na chromatogramach plam o R_F= 0,61-0,62 odpowiadajacym plamie wzorca harpagozydu o R_F= 0,61.

W dalszej części badań określono zawartość harpagozydu w surowcu i tabletkach. W tym celu posłużono się trzema metodami: spektrofotometryczną, TLC i HPLC.

Badania spektrofotometryczne rozpoczęto od ustalenia analitycznej długości fali dla badanego połączenia wzorca harpagozydu i harpagozydu wyizolowanego preparatywnie z surowca (po otrzymaniu chromatogramu TLC dla wyciągu), a odczynnikiem Godina. Pomiary absorbancji prowadzono w zakresie długości fali od 400 nm do 630 nm, stosując jako odnośnik odczynnik Godina. Wyniki przedstawia rycina 1.

Z ryciny 1 wynika, że maksimum absorbancji dla tego połączenia przypada na λ=540 nm.

Znając analityczną długość fali przeprowadzono pomiar absorbancji ekstraktów z surowca i tabletek. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

W celu oznaczenia zawartości harpagozydu metodą TLC w badanym surowcu i tabletkach, wykonano zgodnie z metodyką opisaną w punkcie dotyczącym oznaczania zawartości harpagozydu chromatogram TLC, który przedstawiono na rycinie 3.

Obróbka chromatogramu przy pomocy programu VideoStore firmy Camag (Szwajcaria) pozwoliła na wykreślenie krzywej wzorcowej dla harpagozydu (f=S(c)) przedstawionej na rycinie 4.

Następnie wyliczono zawartość harpagozydu w surowcu i tabletkach na podstawie pól powierzchni piku badanego związku, która wynosi: dla Harpagophyti radix – 7456,0, dla tabletek Pagosid – 5200,8.

Kolejną metodą, która posłużyła do określenia zawartości harpagozydu w korzeniu hakorośli i tabletkach Pagosid była metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) opisana w Farmakopei Europejskiej (4).

Badanie HPLC rozpoczęto od wzorca harpagozydu. Chromatogram przedstawia rycina 5.

Następnie badaniom poddano wyciągi z surowca i tabletek z dodatkiem wzorca wewnętrznego, którym był cynamonian metylu. Wyniki przedstawiają ryciny 6 i 7.

Wyniki analizy ilościowej harpagozydu obecnego w wyciągach z korzenia Harpagophytum i tabletkach Pagosid dla metod: spektrofotometrycznej, TLC i HPLC przedstawia tabela 5 i rycina 8.

Jak wynika z tabeli 5 zawartość harpagozydu w Harpagophyti radix wynosi: 1,25% dla metody spektrometrycznej; 1,29% dla metody TLC i 2,17% dla metody HPLC. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że badany surowiec spełnia wymagania farmakopealne. Farmakopea Europejska (4) wymaga nie mniej niż 1,2% harpagozydu w przeliczeniu na suchą masę. W przypadku tabletek Pagosid zawartość harpagozydu wynosiła 0,85% dla metody spektrofotometrycznej; 1,1% dla metody TLC oraz 0,98% dla HPLC.

Dane przedstawione w tabeli 5 i na rycinie 8 wykazują, że najlepsze wyniki zawartości otrzymano przy zastosowaniu metody HPLC. Może to wynikać z wiekszej czułości metody HPLC, jak i mniejszej ilości błędów popełnianych w trakcie wykonywania analizy.

Zawartość flawonoidów w korzeniu hakorośli rozesłanej oznaczono zgodnie z metodyką FP V (3). Wyniki przedstawia tabela 6.

Z danych zawartych w tabeli 6 wynika, że ogólna zawartość flawonoidów w przeliczeniu na suchą masę w korzeniu hakorośli wynosi średnio 0,0098%.

Analiza jakościowa flawonoidów przebiegała w dwóch etapach. Najpierw podjeto próbę oznaczenia flawonoidów występujących w surowcu w postaci wolnych aglikonów. Chromatogramy otrzymane w wyniku analizy TLC i wywołane w świetle UV (λ=254 i 366 nm) i po spryskaniu metanolowym 5% roztworem AlCl₃, nie wykazywały obecności plam odpowiadających wzorcom flawonoidów.

W dalszej części badań przeprowadzono więc identyfikację flawonoidów po wcześniejszym poddaniu ich hydrolizie. Wynik analizy przedstawiono w tabeli 7.

W toku analizy TLC zidentyfkowano trzy związki flawonoidowe: flawon, luteolinę i kemferol występujące w surowcu w formie zwiaząnej.

Kolejnym etapem badań była analiza jakościowa fenolokwasów obecnych w Harpagophyti radix. W tym celu przeprowadzono badania TLC wyciągów z surowca zawierających wolne fenolokwasy i fenolokwasy poddane hydrolizie 4% kwasem siarkowym. Badania prowadzono na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ w układzie rozwijającym toluen:mrówczan etylu:kwas mrówkowy (5:4:1 v/v), a chromatogramy oglądano w świetle UV (λ=254 nm) i wywoływano 1% metanolowym roztworem FeCl₃. Wyniki przedstawiają ryciny 9 i 10 oraz tabela 8.

Ponadto wykonano badania TLC na płytkach pokrytych celulozą w układzie rozwijającym: woda: dioksan (10:1 v/v).

Chromatogramy wywoływano przez spryskanie 1% metanolowym roztworem FeCl₃. Wyniki przedstawia tabela 9.

Analiza TLC wolnych fenolokwasów w układzie Si-60 G F₂₅₄/toluen:mrówczan etylu:kwas mrówkowy (5:4:1 v/v) wykazała obecność 5 plam związków, z których zidentyfikowano 3: kwas kawowy, cynamonowy i ferulowy. Natomiast z 7 plam uzyskanych dla fenolokwasów po hydrolizie 4% H₂SO₄ zidentyfikowano 4 związki: kwas kawowy, cynamonowy, ferulowy i galusowy.

Chromatografia cienkowarstwowa fenolokwasów wolnych i po hydrolizie w układzie celuloza/woda:dioksan (10:1 v/v) wykazała dla fenolokwasów wolnych 4 plamy, z których zidentyfikowano 2: kwas p -kumarowy i chlorogenowy, a dla fenolokwasów po hydrolizie 7 plam, wśród których oznaczono 3: kwas kawowy, p -kumarowy i chlorogenowy.

Podsumowując, w wyniku analizy TLC w ekstrakcie z korzenia Harpagophytum procumbens DC. zawierającym wolne fenolokwasy zidentyfikowano 5 związków: kwas cynamonowy, ferulowy, p -kumarowy, chlorogenowy i kawowy (w niewielkiej ilości), natomiast w ekstrakcie otrzymanym w wyniku hydrolizy surowca wykazano ponadto obecność kwasu galusowego i znaczne ilości kwasu kawowego.

Kolejnym krokiem w analizie kwasów fenolowych występujących w korzeniu hakorośli były badania HPLC. Dane dotyczące wartości czasów retencji dla wzorców kwasów fenolowych otrzymane w wyniku analizy HPLC podaje tabela 10.

Wyniki analizy HPLC dla ekstraktów z badanego surowca zawierających wolne fenolokwasy i fenolokwasy otrzymane w wyniku hydrolizy surowca przedstawiają ryciny 11 i 12.

Identyfikację poszczególnych fenolokwasów prowadzono na podstawie czasów retencji wzorców i korelacji widm DAD wzorca i odpowiadającego mu piku na chromatogramie.

W tabeli 11 zebrano dane dotyczące analizy fenolokwasów metodą HPLC.

Analiza HPLC potwierdziła występowanie w ekstrakcie zawierającym wolne fenolokwasy i ekstrakcie otrzymanym po hydrolizie surowca kwasów: p -kumarowego, ferulowego i kawowego. Wykazała także obecność postaci wolnej kwasu protokatechowego.

Przeprowadzone badania HPLC, podobnie jak TLC, wskazują również na znacznie większą zawartość kwasu kawowego w ekstrakcie otrzymanym po hydrolizie surowca.

W dalszej części badań określono procentową zawartość garbników w korzeniu hakorośli. Wyniki przedstawia tabela 12.

Jak wynika z tabeli 12 zawartość garbników w korzeniu hakorośli wynosiła średnio 5,53%.

Analizę jakościową garbników przeprowadzono dla wyciągu z surowca zawierającego te związki w postaci niezwiązanej i dla wyciągów otrzymanych w wyniku hydrolizy surowca. Badania przeprowadzono metodą TLC w 5 układach:

– poliamid/metanol:woda:kwas octowy (20:12,5:1 v/v),

– poliamid/metanol:woda:dioksan:kwas octowy (20:12:1:1 v/v),

– Si-60 G F₂₅₄/toluen:mrówczan etylu:kwas mrówkowy (5:4:1 v/v),

– celuloza/woda:dioksan (5:1 v/v),

– celuloza/woda:dioksan (10:1 v/v).

Najlepsze wyniki uzyskano stosując układ celuloza//woda:dioksan (10:1 v/v). Chromatogramy wywoływano stosując 1% metanolowy roztwór FeCl₃ i odczynnik Godina. Wyniki przedstawiono w tabelach 13 i 14.

Z danych przedstawionych w tabelach 13 i 14 wynika, że w surowcu nie występują garbniki hydrolizujące pochodne katechiny. Można natomiast stwierdzić obecność garbników hydrolizujących pochodnych kwasu galusowego. Świadczy o tym obecność w wyciągu z surowca poddanego hydrolizie plamy kwasu galusowego o R_F= 0,45 dla chromatogramu wywołanego 1% metanolowym roztworem FeCl₃ i o R_F= 0,44 dla chromatogramu wywołanego odczynnikiem Godina. Występowanie w surowcu kwasu galusowego w formie związanej potwierdziła również analiza TLC fenolokwasów na żelu krzemionkowym (ryc. 11 i 12). W celu potwierdzenia lub wykluczenia obecności garbników hydrolizujących pochodnych kwasu elagowego wykonano analizę TLC na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym Si-60 G F₂₅₄ w układzie rozwijającym: octan etylu:kwas mrówkowy:kwas octowy:woda (100:11:11:27 v/v).

W wyniku tej analizy wykluczono obecność kwasu elagowego w obu badanych wyciągach, co wskazuje na brak elagotanin w surowcu.

Przeprowadzone badania TLC nad obecnością garbników w korzeniu hakorośli rozesłanej wykazały obecność kwasu kawowego w wyciągu otrzymanym po hydrolizie surowca. Może to świadczyć o obecności w surowcu garbników pochodnych kwasu kawowego, tzw. kawolidów.

Powyższe stwierdzenie potwierdzałyby również analizy TLC i HPLC fenolokwasów, w wyniku których wykazano wzrost zawartości kwasu kawowego w wyciągu z surowca, który został poddany hydrolizie w stosunku do wyciągu zawierającego wolne fenolokwasy (ryc. 11 i 12).

Dyskusja

Badania nad składem chemicznym korzenia hakorośli rozesłanej wykonane w prezentowanej pracy potwierdziły dane literaturowe dotyczące substancji biologicznie aktywnych obecnych w Harpagophyti radix (6-14). Analiza fitochemiczna pozwoliła również na stwierdzenie występowania w surowcu związków biologicznie aktywnych, które nie zostały opisane w dostępnym piśmiennictwie.

Jak wynika z danych piśmiennictwa zawartość harpagozydu w korzeniu hakorośli rozesłanej waha się w granicach od 0,1 do 3,0% (7, 9, 15). Farmakopea Niemiecka DAB 10 (16) wymaga, aby surowiec zawierał nie mniej niż 1% tego związku, a Farmakopea Europejska (4) – nie mniej niż 1,2% harpagozydu w przeliczeniu na suchą masę.

Badania nad zawartością harpagozydu w badanym surowcu i tabletkach Pagosid przeprowadzono trzema metodami: spektrofotometryczną, TLC i HPLC. Otrzymane wyniki w przypadku surowca zawierają się w granicach: od 1,25% (met. spektrofotometryczna) do 2,17% (met. HPLC). Dla tabletek Pagosid wyniki kształtują sie następująco: 0,77% – dla oznaczenia spektrofotometrycznego 0,87% – dla metody HPLC i 0,99% – dla TLC. Wyniki zawartości otrzymane w toku przedstawionych badań wykazały, że surowiec spełnia wymagania obu farmakopei co do zawartości głównego składnika biologicznie aktywnego, jakim jest harpagozyd. W przypadku preparatu Pagosid, który zawiera suchy wyciąg z surowca, zawartość harpagozydu jest niższa od wymaganej.

Analiza fitochemiczna surowca dotyczyła również związków fenolowych obecnych w Harpagophyti radix, takich jak flawonoidy i fenolokwasy.

Bradley (7), Nervall i wsp. (11) oraz inni autorzy (6, 13-15) donoszą o obecności w korzeniu hakorośli rozesłanej związków flawonoidowych pochodnych luteoliny i kemferolu. Przeprowadzone badania TLC potwierdziły te dane i wykazały ponadto obecność w ekstrakcie uzyskanym po hydrolizie surowca flawonu. Nie stwierdzono natomiast obecności flawonoidów, które występowałyby w surowcu w postaci wolnych aglikonów. Leksykon leków weterynaryjnych (14) podaje, że ogólna zawartość flawonoidów w korzeniu Harpagophytun procumbens wynosi 0,0185%. Dane otrzymane w wyniku oznaczenia przeprowadzonego zgodnie z metodyką opisaną w FP V (3) wykazały prawie dwukrotnie mniejszą zawartość tych związków w badanym surowcu (0,0098%).

Dane piśmiennictwa dotyczące występowania w korzeniu hakorośli fenolokwasów wskazują na obecność trzech związków: kwasu cynamonowego, kawowego i chlorogenowego (depsyd kwasu kawowego i chinowego) (7, 10, 16). Analizy TLC i HPLC potwierdziły występowanie w surowcu tych kwasów. Ponadto wykazano obecność innych związków pochodnych kwasu cynamonowego: kwasu p -kumarowego i ferulowego. W wyniku analizy stwierdzono również występowanie kwasu protokatechowego i kwasu galusowego (w formie związanej). Oba te związki są pochodnymi kwasu benzoesowego.

Po raz pierwszy podjęto próby oznaczenia ilościowego i jakościowego tanin i garbników w Harpagophyti radix.Zawartość procentowa tych związków oznaczona zgodnie z metodyką opisaną w FP IV (5) wynosi 5,53%. Badania jakościowe na obecność hydrolizujących i niehydrolizujących pochodnych katechiny prowadzono metodą chromatografii cienkowarstwowej. Analiza wykazała brak w surowcu garbników skondensowanych pochodnych katechiny i hydrolizujących pochodnych kwasu elagowego. Stwierdzono natomiast obecność galotanin, o czym świadczy występowanie w ekstrakcie z surowca poddanego hydrolizie kwasu galusowego. Badania TLC wykazały również obecność w tym ekstrakcie kwasu kawowego, co może dowodzić, że we frakcji garbnikowej korzenia Harpagophytum występują związki pochodne tego kwasu. Borkowski i Miłkowska (17) związki takie nazywają kawolidami i wydzielają je spośród garbników hydrolizujących jako osobną grupę. Kawolidy według nich są to estry kwasu kawowego i jego analogów: kwasu chlorogenowego, rozmarynowego, p -kumarowego i in. Wydzielenia tej grupy związków autorzy ci dokonali na podstawie szczególnych właściwości immunomodulacyjnych, a w szczególności działania przeciwwirusowego (17).

Występowanie w badanym surowcu związków pochodnych kwasu kawowego potwierdzają również badania TLC i HPLC kwasów fenolowych, w wyniku których zaobserwowano wzrost zawartości kwasu kawowego w ekstrakcie z surowca poddanego hydrolizie w porównaniu z ekstraktem zawierającym wolne fenolokwasy.

Wykonane badania fitochemiczne surowca leczniczego, jakim jest korzeń hakorośli rozesłanej (Harpagophytum procumbens DC.) potwierdzają, że głównym jego składnikiem jest harpagozyd. Przybliżyły one również skład chemiczny innych grup związków obecnych w surowcu, tj. flawonoidów, fenolokwasów i garbników, które zostały oznaczone po raz pierwszy w badanym surowcu.

Badania ostatnich lat wykazują, że harpagozyd nie jest jedynym związkiem warunkującym główne działanie lecznicze surowca, ponieważ wyizolowany działa słabiej od ekstraktów otrzymanych z korzenia (6). Stąd celowość badań nad chemizmem korzenia Harpagophytum procumbens DC. i nad synergizmem działania poszczególnych grup zwiazków w nim występujących.

Wnioski

Z przeprowadzonych badań wynikają następujące wnioski.

1. Badania ilości harpagozydu przeprowadzono trzema metodami: spektrofotometryczną, TLC i HPLC, które dla surowca dały następujące wyniki: 1,25%; 1,29% i 2,17%, zaś dla preparatu Pagosid odpowiednio: 0,77%; 0,99% i 0,87%.

2. Z powyższych danych wynika, że surowiec spełnia wymagania Farmakopei Europejskiej (nie mniej niż 1,2% harpagozydu) i DAB 10 (nie mniej niż 1,0% harpagozydu). W przypadku preparatu Pagosid, zawierającego suchy ekstrakt z surowca, zawartość harpagozydu jest niższa od wymaganej.

3. Analiza jakościowa flawonoidów w surowcu nie wykazała obecności związków występujących w postaci wolnych aglikonów. Stwierdzono natomiast obecność związków występujących w formie glikozydowej, tj. luteoliny, kemferolu i flawonu. Zawartość tych związkow w surowcu wynosi ok. 0,01% w przeliczeniu na kwercetynę.

4. Analiza fenolokwasów występujących w postaci wolnej wykazała obecność kwasów: cynamonowego, ferulowego, p -kumarowego, chlorogenowego, kawowego i protokatechowego. Ponadto w ekstrakcie otrzymanym w wyniku hydrolizy surowca zidentyfikowano kwas galusowy.

5. Zawartość procentowa garbników w surowcu wynosi 5,53% w przeliczeniu na suchą masę. Analiza jakościowa związków garbnikowych obecnych w Harpagophyti radix wyklucza obecność garbników skondensowanych pochodnych katechiny. Wykazano natomiast obecność galotanin i garbników pochodnych kwasu kawowego, tzw. kawolidów.

6. Po raz pierwszy przeprowadzono analizę ilościową harpagozydu po derywatyzacji odczynnikiem Godina. Wyznaczono maksimum absorbancji barwnego kompleksu, które wynosiło 540 nm. Przedstawiona w pracy metoda może służyć do ilościowych badań skriningowych zawartości harpagozydu w preparatach farmaceutycznych oraz suplementach diety.

Piśmiennictwo

1. Wolski T, Baj T, Ludwiczuk A i wsp. Hakorośl rozesłana ( Harpahophytum procumbens DC.) – roślinny surowiec o wielokierunkowym działaniu farmakologicznym. Post Fitoter 2010; (1);13-22. 2. ESCOP Monographs. Thieme 2009. 3. Farmakopea Polska V, PTF, Warszawa 1999. 4. European Pharmacopoeia 3^rd Edition. 1997. 5. Farmakopea Polska IV, T II, PZWL, Warszawa 1970. 6. Blumenthal M i wsp. The complete German Commission E Monographs – Therapic guide to herbal medicines. 1998; 248-50. 7. Bradley PR. British herbal compendium. 1992; 78-80. 8. Czygan F-C, Krüger A, Schier W i wsp. Pharmazeutisch-biologische Untersuchungen der Gattung Harpagophytum (Burch.) DC. ex Meissn. 1. Mitteilung: Phytochemische Standardisierung von Tubera Harpagophyti. Dtsch Apoth Ztg 1977; 117:1431-4. 9. Hojden B. Czarci pazur – ziele o działaniu przeciwreumatycznym. Wiad Ziel 1994; 36(11). 10. Lamer-Zarawska E. Lecznicze właściwosci Harpagophytum procumbens. Wiad Ziel 2000; 10. 11. Nervall CA, Anderson LA, Phillipson JD. Herbal Medicines, The Pharmaceutical Press 1996; 296. 12. Schmidt M, Eich J, Kreimeyer J i wsp. Teufels-kralle Sichere pharmaceutische Qualitat durch kontrollierten Anbau. Dtsch Apoth Ztg 1998; 47(138):4540-9. 13. Wegener T, Wiedenbrück R. Die Teufelskralle ( Harpagophytum procumbens DC.) in der Therapie rheumatischen Erkrankungen. Ztsch f Phytother 1998; 19:284-94. 14. www.emea.eu.int/pdfs/vet/mvls/067099en.pdf. 15. Czygan F-C. Harpagophytum – Teufelskralle. Ztsch f Phytother 1987; 8:17-20. 16. Farmakopea Niemiecka DAB 10. 1993. 17. Borkowski B, Miłkowska K. Garbniki, tanoidy i związki pokrewne IV. Kawolidy. Herba Pol 1996; 42(3):174-81.

otrzymano/received: 2010-07-17
zaakceptowano/accepted: 2010-08-21

Adres/address:
*Tadeusz Wolski
Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych UM w Lublinie
ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin
tel.: (81) 742-38-10, fax: (81) 742-38-09
e-mail: twolski@pharmacognosy.org

Artykułu Analiza fitochemiczna korzeni hakorośli rozesłanej ( Harpagophytum procumbens DC.) w Czytelni Medycznej Borgis.

Analiza fitochemiczna korzeni hakorośli rozesłanej ( Harpagophytum procumbens DC.)