Postępy Fitoterapii - Wydawnictwo Medyczne Borgis - Przegląd badań <i>in vitro </i>oceniających aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku z drzewa herbacianego (<i> Tea Tree Oil</i>). Cz. I

Aleksandra Garbusińska, *Anna Mertas, Wojciech Król

Przegląd badań in vitro oceniających aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku z drzewa herbacianego ( Tea Tree Oil). Cz. I

The review of the research in vitro of Tea Tree Oil antimicrobial activity

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. n. med. Wojciech Król

Summary
Tea Tree Oil (TTO) is the natural substance obtained by steam distillation from the plant Melaleuca alternifolia. That essential oil is a complex mixture of monoterpenes, sesquiterpenes and related alcohols, consisting of approximately 100 components. The concentrations of these components are stipulated by an Australian Standard. Terpinen-4-ol (one of the putative antimicrobial components) should be at least 30% of the TTO while 1,8-cineole (reputedly a skin irritant) should be less than 15%. TTO exhibits a broad spectrum of antimicrobial activity against a wide range of Gram-positive and Gram-negative bacteria, viruses and fungi (yeasts and dermatophytes). TTO is used medicinally as a topical antiseptic in the treatment of the mucosal and cutaneous infections.
The antibacterial and antifungal effectiveness of TTO and its components were tested in vitro including clinically significant microorganisms. Most reported studies were based on using of the broth dilutions methods. In this method a serial doubling dilutions of each agent were prepared in broth, inoculated with microorganism cells suspension and incubated. Following this MIC (Minimal Inhibitory Concentration) was determined as the lowest concentration of the study substance resulting in the visual reduction of the growth of the inoculum. MBC or MFC (Minimal Bactericidal or Fungicidal Concentration) were determined as the lowest concentration of the study substance resulting in the death 99,9% or more of the inoculum. In reported agar diffusion methods the paper discs impregnated with TTO or oil component were placed on the inoculated agar surfaces. After incubation the zones of growth inhibition were determined. In another method, assessed the viability of the microorganisms with the time-kill curves determinations, antimicrobial effect of TTO or its components was evaluated by measuring the levels reduction in the numbers of CFU/ml over a specified time.
The mechanism of antimicrobial action of TTO was elucidated too. TTO treatment of microorganisms cells resulted in the loss of cell membrane integrity and its function. In the electron microscopy the bacteria cells treated with TTO and its components showed morphology changes. Inhibition of cells respiration and the leakage of K⁺ ions from bacteria in response to TTO and the rate of this efflux were monitored too.

Key words: melaleuca alternifolia, tea tree oil, antimicrobial activity

Wprowadzenie

Narastająca oporność drobnoustrojów na dotychczas stosowane konwencjonalne leki przeciwdrobnoustrojowe i w związku z tym występowanie coraz większej ilości trudnych do leczenia zakażeń stwarza pilną potrzebę poszukiwania nowych, skutecznych metod terapii, alternatywnych do obecnie stosowanych lub też stanowiących ich uzupełnienie. Obecnie coraz większe uznanie zyskują substancje biologicznie czynne pochodzenia roślinnego, których przykładem są olejki eteryczne wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum i zarazem bezpieczne dla organizmu pacjenta. Na szczególną uwagę zasługuje olejek z drzewa herbacianego (TTO – ang. Tea Tree Oil) pozyskiwany z australijskiej rośliny Melaleuca alternifolia i używany od wieków do celów leczniczych przez rdzennych mieszkańców tego kraju, a także kolonizatorów australijskich. TTO wykorzystywano do oczyszczania i leczenia ran, przeciwko przeziębieniom, bólom głowy, do higieny jamy ustnej i inhalacji, jako środek o właściwościach przeciwszkorbutowych, do sporządzania środków dezynfekujących, a ponadto liście Melaleuca alternifolia stosowano do zaparzania herbaty (1, 2, 3).

Melaleuca alternifolia to krzew z rodziny mirtowatych ( Myrtaceae) osiągający wysokość do 7 metrów, mający krzaczastą koronę i białą korę (ryc. 1). Roślina ta rośnie w stanie dzikim w zachodnich (2) i południowych regionach Australii oraz w rejonie Azji Południowo-Wschodniej i Pacyfiku (4), a także na plantacjach zlokalizowanych głównie w rejonie Nowej Południowej Walii w Australii (3).

Ryc. 1. Melaleuca alternifolia – pokrój rośliny (wg 52).
Zdjęcie zamieszczono za zgodą Wydawnictwa MedPharm Polska.

Naprzeciwlegle ułożone liście Melaleuca alternifolia są kształtu lancetowatego, osiągają długość od 2,5 do 3,5 cm i mają liczne gruczoły olejkowe (ryc. 2). Młode pędy i kwiatostany są owłosione. Kwiatostan jest w postaci kłosu do 5 cm długości, natomiast niewielkie owoce są kształtu kulistego (2, 5).

Ryc. 2. Melaleuca alternifolia – kwitnąca gałązka rośliny (wg 52).
Zdjęcie zamieszczono za zgodą Wydawnictwa MedPharm Polska.

Olejek z drzewa herbacianego (TTO) pozyskuje się metodą destylacji parą wodną rośliny zebranej w okresie od listopada do maja (2, 3, 6-8). Jest to wieloskładnikowa, bezbarwna lub jasnożółta ciecz o korzennym zapachu, a jej skład zależy od właściwości rośliny i warunków produkcji. Z kolei siła przeciwdrobnoustrojowego działania każdej wyprodukowanej serii TTO jest uwarunkowana przede wszystkim zawartością terpinen-4-olu, który powinien stanowić ≥30% składu olejku. Tabela 1 przedstawia wykaz najważniejszych składników TTO według normy ISO 4730: 2004 (tab. 1) (6).

Tabela 1. Skład chemiczny TTO według normy ISO 4730: 2004 (6).

Lp.	Składnik	Zawartość (%)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.	terpinen-4-ol g-terpinen a-terpinen 1,8-cyneol a-terpinolen p-cymen a-pinen a-terpineol aromadendren s-cadinen limonen sabinen globulol viridiflorol	ł30 10-28 5-13 Ł15 1,5-5 0,5-12 1-6 1,5-8 Ł7 Ł8 0,5-4 Ł3,5 Ł3 Ł1,5

Obecnie TTO jest coraz częściej stosowany leczniczo jako silny antyseptyk. Liczne prace prezentujące wyniki badań in vitro właściwości TTO i możliwości jego zastosowań potwierdzają przeciwdrobnoustrojową aktywność tego olejku. TTO jest antyseptykiem polecanym w leczeniu schorzeń o różnej etiologii. Ze względu na właściwości, takie jak lipofilność oraz dobra rozpuszczalność w wydzielinie gruczołów łojowych, substancja ta łatwo penetruje zewnętrzne warstwy skóry (3, 4, 9-11), a następnie składniki olejku przedostają się do układu krążenia i układu limfatycznego oraz do zakończeń nerwowych w skórze. Przenikanie przebiega szybko i co jest bardzo istotne – aplikowany preparat, przechodząc do tkanek, nie zmienia swego składu chemicznego, a więc zachowuje swoje pierwotne właściwości lecznicze.

Wprowadzanie olejku do organizmu przez skórę odbywa się poprzez zabiegi, takie jak masaże, kąpiele, kompresy, pędzlowanie, smarowanie maścią, kremami, tonikami, itp. Ze względu na właściwości rozgrzewające olejku jest on używany także do nacierań po urazach, skurczach mięśni, skręceniach czy w odmrożeniach. TTO jest stosowany w terapii schorzeń skórnych, takich jak łupież (3, 4, 8), łupież pstry (2, 11), łuszczyca (3-5, 11), rumień pieluszkowy i egzemy (11), grzybice skóry głowy, grzybice stóp (1-4, 6, 11, 12), drożdżyca paznokci, wyprzenia drożdżakowe (11), zapalenia łojotokowe skóry (2, 5), pękanie, przesychanie i swędzenie skóry (3, 5, 11), stwardnienia i odciski (5), oparzenia skóry (3, 5, 11), podrażnienia skóry (2, 11), owrzodzenia żylakowe i cukrzycowe (3, 11), zakażone rany (10, 11), gojące się rany (2), wrzody, czyraki, ropnie (11, 13), choroby skóry owłosionej i łysienie, rumień, wykwity, alergie kontaktowe, wypryski atopowe (5), zanokcica (11), liszajec zakaźny (11), brodawki (3, 11), trądzik o etiologii gronkowcowej lub wywołany przez Propionibacterium acnes (2-6, 11, 14).

TTO z powodzeniem zwalcza zakażenia grzybicze i bakteryjne jamy ustnej: afty, zajady, pleśniawki (1-5, 8, 11, 13-16), w tym kandydozy jamy ustnej i gardła u pacjentów z objawami AIDS, powodowane przez flukonazolooporne szczepy Candida spp. (12, 17-19). Dobre efekty kliniczne uzyskuje się stosując TTO w zakażeniach górnych dróg oddechowych (stanach przeziębieniowych, nieżytach gardła i nosa, zapaleniu migdałków podniebiennych, zatok przynosowych, oskrzeli), wprowadzając olejek bezpośrednio do dróg oddechowych przez inhalacje (1, 4, 20). Należy wskazać również na skuteczność działania TTO wobec wirusów opryszczki (14, 15, 21, 22) oraz wirusów grypy (2). Działające miejscowo preparaty z dodatkiem TTO skuteczne są w zwalczaniu zakażeń pochwy (3, 5, 6, 8, 11) powodowanych przez różne czynniki etiologiczne, głównie Candida spp., Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis,bakterie beztlenowe, czy wirus brodawczaka (3, 11, 23, 24). Sporadycznie olejek ten ma zastosowanie w leczeniu zakażeń dróg moczowych (1, 3, 11), zapaleń ucha (5), zwalczaniu zakażeń jelitowych (10), hemoroidów (5), robaczyc (6), łagodzeniu skutków użądleń przez owady (10, 11), czy też niszczeniu roztoczy w kurzu domowym (2).

TTO wykazuje ponadto właściwości uspakajające, miejscowo znieczulające oraz uodparniające, wyrażone wzrostem stężenia immunoglobulin we krwi po cyklu leczenia (2, 3, 10). TTO jest dodawany w stężeniach terapeutycznych jako konserwant do preparatów kosmetycznych, chroniąc je tym sposobem przed rozwojem drobnoustrojów, głównie: Candida albicans, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Aspergillus niger (10). Ostatnio zainteresowano się TTO jako środkiem do eradykacji bakterii z rodzaju Legionella ze szpitalnych instalacji wodno-kanalizacyjnych (25).

Agarowa metoda dyfuzyjna

Agarowa metoda dyfuzyjna to jedna z metod badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej TTO i jego składników. Stosowano najczęściej metodę dyfuzyjną, tzw. bezpośredniego kontaktu, a sporadycznie kontaktu z parami olejku. W pierwszym przypadku krążki bibułowe nasączone TTO nakładano na powierzchnię płytki Petriego z podłożem agarowym posianym zawiesiną szczepu drobnoustroju o określonej gęstości. Olejek z krążka dyfundował do podłoża, powodując powstanie stref zahamowania wzrostu drobnoustroju dookoła krążków. Z kolei w metodzie kontaktu z parami, nasączony olejkiem krążek mocowano na wieczku płytki Petriego. Pary olejku z krążka po zetknięciu się z posianym podłożem hamowały wzrost bakterii. Miarą aktywności przeciwdrobnoustrojowej substancji ocenianej obydwoma sposobami była wielkość strefy zahamowania wzrostu szczepu mierzona w milimetrach. Agarową metodę dyfuzyjną stosowano w badaniach aktywności przeciwdrobnoustrojowej nie tylko TTO (25, 26, 27), ale również jego składników (28) oraz mieszanin TTO z innymi substancjami (27, 29).

Ergin i Arikan (26) zastosowali metodę dyfuzyjną bezpośredniego kontaktu do oceny aktywności TTO wobec 99 szczepów Candida spp. wyizolowanych z pochwy. Uzyskane strefy zahamowania wzrostu wskazywały na znaczną aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku, bowiem po 24-godzinnej inkubacji wielkości te mieściły się w przedziale od 14,0 do 42,0 mm (wartość średnia 24,0 mm), natomiast po 48-godzinnej inkubacji w przedziale od 10,0 do 35,0 mm (wartość średnia 15,8 mm).

Ocena aktywności przeciwbakteryjnej TTO i kilku innych olejków eterycznych była celem eksperymentów przeprowadzonych przez Edwards-Jones i wsp. (27). Zastosowano szczepy Staphylococcus aureus: jeden wzorcowy oraz dwa kliniczne (metycylinooporne). Dla TTO w metodzie dyfuzyjnej bezpośredniego kontaktu uzyskano znacząco wyższe strefy zahamowania wzrostu w przypadku badań klinicznych metycylinoopornych szczepów niż w przypadku szczepu wzorcowego. Z kolei w metodzie kontaktu z parami uzyskano wyższe strefy inhibicji dla szczepu wzorcowego w porównaniu ze szczepami klinicznymi. W badaniach mieszanin TTO z innym olejkiem, przeprowadzonych metodą bezpośredniego kontaktu, stwierdzono wyższe strefy inhibicji dla badanych szczepów w porównaniu z analogicznym eksperymentem przeprowadzonym metodą kontaktu z parami olejku. Wyniki wskazały na ogólnie niską aktywność antybakteryjną par olejków eterycznych.

Metodę bezpośredniego kontaktu oraz kontaktu z parami TTO zastosowano także w badaniach przeprowadzonych przez Mondello i wsp. (25). Użyto 4 różne serotypy szczepów wzorcowych bakterii Legionella pneumophila. W obydwu metodach uzyskano podobne wyniki, tzn. po dwóch dniach inkubacji nastąpiła całkowita inhibicja wzrostu bakterii, natomiast po sześciu dniach inkubacji obserwowano wprawdzie nadal zahamowanie wzrostu, ale wystąpił już niewielki wzrost kolonii bakterii.

Aktywność przeciwdrobnoustrojowa składników TTO: 1,8-cyneolu, linalolu, terpinen-4-olu, α-terpineolu, p-cymenu, α-terpinenu, γ-terpinenu, terpinolenu wobec wzorcowych szczepów drobnoustrojów, takich jakBacillus subtilis, Bacteroides fragilis, Candida albicans, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Moraxella catarrhalis, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, była przedmiotem badań Carson i Riley (28). Składnikiem o najwyższej aktywności przeciwdrobnoustrojowej okazał się terpinen-4-ol. Wzrost szczepów: Bacteroides fragilis, Candida albicans, Clostridium perfringens był hamowany przez wszystkie składniki, natomiast wzrost Pseudomonas aerugonosa jedynie przez terpinen-4-ol.

Badania Hinou i wsp. (30) były kolejnym przykładem oceny aktywności przeciwbakteryjnej składników TTO. Użyto 32 składniki TTO oraz trzy wzorcowe szczepy bakterii: Staphylococcus aureus NCTC 6571, Escherichia coli NCTC 9001 i Pseudomonas aeruginosa NCTC 6750. Przyjętym kryterium interpretacyjnym wysokiej aktywności przeciwdrobnoustrojowej badanej substancji wobec użytego szczepu było uzyskanie strefy zahamowania wzrostu bakterii powyżej 16 mm. Szczep Staphylococcus aureus był wrażliwy na 25 składników TTO ze wszystkich użytych w badaniu, Escherichia coli na 11, a Pseudomonas aerugonosa tylko na 6 składników.

Metodą dyfuzyjną przeprowadzono także badania porównujące efekt inhibicji wzrostu szczepów Candida albicans spowodowany działaniem TTO użytego oddzielnie, z efektem inhibicji wzrostu tych samych szczepów spowodowanym działaniem TTO w połączeniu z amfoterycyną B (29). Parametrem porównawczym była wielkość strefy zahamowania wzrostu badanego szczepu Candida albicans wokół krążków zawierających TTO, amfoterycynę B oraz zawierających TTO w połączeniu z amfoterycyną B. Dla wszystkich zbadanych szczepów grzybów uzyskano większe o kilka milimetrów strefy zahamowania wzrostu wokół krążków zawierających obydwie substancje. Wyniki badań potwierdziły istnienie efektu synergizmu działania TTO i amfoterycyny B wobec szczepów Candida albicans.

Ilościowa metoda rozcieńczeniowa

Ilościowa metoda rozcieńczeniowa to obecnie najczęściej stosowana metoda oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej TTO i jego składników. W tych badaniach zawiesinę szczepu drobnoustroju o określonej gęstości eksponowano na serię dwukrotnych rozcieńczeń TTO w podłożu płynnym bądź stałym w celu określenia wartości MIC (ang. – Minimal Inhibitory Concentration), tj. najmniejszego stężenia substancji hamującego wizualny wzrost drobnoustroju, czy też wartości MBC (ang. – Minimal Bactericidal Concentration) lub MFC (ang. – Minimal Fungicidal Concentration), tj. najmniejszych stężeń TTO zabijających 99,9% początkowego inoculum, odpowiednio – bakterii lub grzybów. Wartości te najczęściej wyrażano jako stężenia procentowe TTO, rzadziej w mg/ml.

Stosując metody rozcieńczeniowe, oceniano aktywność TTO i jego składników wobec drobnoustrojów izolowanych z przypadków chorób skóry, błon śluzowych, układu oddechowego oraz zakażeń oportunistycznych. Alkiewicz i wsp. (4) badali wrażliwość na TTO szczepów bakterii wyhodowanych od dzieci z przewlekłymi zakażeniami górnych dróg oddechowych (tj. bakterii Gram-dodatnich z rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium oraz Gram-ujemnych, w większości z rodzajów Pseudomonas, Escherichia i Neisseria). Aż 75% szczepów odznaczało się wrażliwością na TTO, gdyż wartości MIC mieściły się w przedziale <0,1 do 1,0 mg/ml, natomiast 25% szczepów zaliczono do średnio wrażliwych, dla których wartości MIC wyniosły od 2,5 do 5,0 mg/ml. Wzrost bakterii Gram-dodatnich był hamowany przez TTO w stężeniach <0,1 do 2,5 mg/ml, natomiast wzrost bakterii Gram-ujemnych w stężeniach od 0,1 do 5,0 mg/ml. Najbardziej wrażliwe na działanie TTO były szczepy Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Corynebacterium ulcerans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Haemophilus influenzae, Neisseria polysaccharea, Moraxella catarrhalis.

W badaniach wykonanych w tym samym ośrodku, również dotyczących przypadków przewlekłych nieżytów górnych dróg oddechowych dzieci (20), wyizolowano łącznie 27 szczepów drobnoustrojów, w tym ziarenkowce z rodzaju Streptococcus, Staphylococcus, pałeczki Gram-ujemne z rodzaju Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Acinetobacter, Haemophilus oraz grzyby z rodzaju Candida. Olejek TTO hamował wzrost drobnoustrojów w granicach stężeń od 0,5 do 5,0 mg/ml, natomiast bakteriobójczo działał w stężeniach od 1,0 do 7,5 mg/ml. Dla ziarenkowców Gram-dodatnich uzyskano wartości MIC w przedziale od 0,5 do 2,5 mg/ml, a wartości MBC od 1,0 do 5,0 mg/ml. Dla Candida spp. wartości MIC dla TTO mieściły się w przedziale od 0,75 do 2,5 mg/ml, a MBC od 2,0 do 5,0 mg/ml, natomiast dla pałeczek Gram-ujemnych MIC dla TTO wyniósł od 0,75 do 5,0 mg/ml, a MBC od 1,0 do 7,5 mg/ml. Najwyższe wartości MIC (5,0 mg/ml) uzyskano dla pałeczek Escherichia coli oraz pałeczek z rodzaju Klebsiella i Enterobacter.

Kędzia i wsp. (1) od chorych z objawami ostrego lub przewlekłego zakażenia dróg oddechowych wyizolowali 91 szczepów bakterii Gram-ujemnych beztlenowych należących do rodzajów Prevotella, Porphyromonas, Bacteroides, Fusobacterium, Veillonella oraz 47 szczepów bakterii Gram-dodatnich beztlenowych należących do rodzajów Micromonas, Finegoldia, Peptostreptococcus, Actinomyces, Propionibacterium, Eubacterium. Wzrost ok. 58% bakterii Gram-ujemnych oraz ok. 77% bakterii Gram-dodatnich był hamowany przez stężenia TTO w zakresie ≤0,03 do 0,5 mg/ml. Wzrost bakterii Gram-dodatnich był zatem skuteczniej hamowany przez zastosowane stężenia TTO niż wzrost bakterii Gram-ujemnych.

Banes-Marshall i wsp. (31) badali aktywność olejku TTO wobec drobnoustrojów wyhodowanych z przypadków schorzeń skórnych ( Staphylococcus aureus – w tym również szczepy metycylinooporne, gronkowce koagulazoujemne, pałeczki z grupy coli,paciorkowce β-hemolityczne, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Candida spp.). Dla większości szczepów wartości MIC dla TTO znajdowały się w przedziale stężeń od 0,5 do 1,0%. Najbardziej wrażliwe na TTO okazały się szczepy Staphylococcus aureus i Candida spp. z wartościami MIC dla TTO równymi 0,5%. Wartości MIC dla szczepów Pseudomonas aeruginosa i enterokoków były wysokie (tj. powyżej 8%), co oznaczało oporność tych szczepów na działanie TTO.

W eksperymencie przeprowadzonym przez Elsom i Hide (32) zbadano wrażliwość na TTO 100 klinicznych metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus, uzyskując wartości MIC w przedziale od 0,16 do 0,32% (z wartością średnią równą 0,32%) oraz wartości MBC w przedziale od 0,32 do 1,25% (z wartością średnią równą 0,64%). Z kolei w badaniach przeprowadzonych przez Kwiecińskiego i wsp. (33) wartości MIC TTO dla klinicznych szczepów Staphylococcus aureus mieściły się w granicach od 0,125 do 0,5%, a wartości MBC odpowiednio od 0,25 do 1,0%.

Przeprowadzono szereg badań oceniających aktywność TTO wobec grzybów. Hammer i wsp. (34) dla 184 klinicznych szczepów grzybów (w tym 106 dermatofitów z rodzajów Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton oraz 78 szczepów z rodzajów Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Penicillium) uzyskali niskie wartości MIC mieszczące się w przedziale od 0,004 do 0,25%. Dla dermatofitów uzyskano wartości MIC niższe (wartość MIC od 0,004 do 0,06%) niż dla pozostałych rodzajów grzybów (wartość MIC od 0,008 do 0,25%). W swoich badaniach Bagg i wsp. (18) dla 301 szczepów Candida spp. wyhodowanych z materiału pobranego od pacjentów z zaawansowaną chorobą nowotworową, również zaobserwowali niskie wartości MIC TTO, mieszczące się w przedziale od 0,125 do 1,0%.

Vazquez i wsp. (35) badali wrażliwość na TTO klinicznych szczepów grzybów pochodzących z oportunistycznych zakażeń jamy ustnej ( Candida albicans, non-albicans Candida spp., Aspergillus fumigatus i Aspergillus nidulans). TTO wykazał znaczące działanie hamujące wobec szczepów Candida spp., natomiast wzrost szczepów Aspergillus spp. nie był hamowany przez TTO w zastosowanych stężeniach. Najbardziej wrażliwymi na TTO były szczepy Candida albicans, Candida parapsilosis i Candida kefyr (z wartościami MIC w przedziale od 0,06 do 0,25%).

Hammer i wsp. (36) określili wrażliwość na TTO 81 szczepów Candida albicans i 33 szczepów non-albicans Candida spp. Badania wykonano metodą mikrorozcieńczeniową w bulionie i uzyskano wartości MIC₉₀ równe 0,25%. (MIC₉₀– to minimalne stężenie substancji hamujące wzrost 90% badanych drobnoustrojów). Wartości MFC₉₀ wyniosły odpowiednio: dla Candida albicans 0,25%, a dla non-albicans Candida spp. 0,5%. Z kolei stosując metodę rozcieńczeń w agarze, wyznaczono dla 57 szczepów Candida spp. wartość MIC₉₀ równą 0,5%.

Ocena właściwości przeciwdrobnoustrojowych pojedynczych składników TTO również była przedmiotem przeprowadzonych eksperymentów. Carson i Riley (28) badali aktywność ośmiu składników TTO wobec szczepów: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.Największą przeciwdrobnoustrojową aktywnością wykazał się linalol, terpinen-4-ol, α-terpineol z wartościami MIC i MBC dla Candida albicans i Staphylococcus aureus – 0,25% oraz wartościami MIC i MBC dla Escherichia coli – 0,06%. Mniejszą aktywnością wykazał się 1,8-cyneol. Wartości MIC i MBC dla γ-terpinenu, terpinolenu i α-terpinenu były natomiast wysokie, tj. do 2%. W stosunku do wszystkich testowanych drobnoustrojów zupełnym brakiem aktywności wykazał się p-cymen, z wartościami MIC i MBC powyżej 8%.

Aktywność przeciwdrobnoustrojowa TTO oraz terpinen-4-olu, γ-terpinenu, p-cymenu i 1,8-cyneolu, wobec szczepów referencyjnych: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans była badana przez Cox i wsp. (16). Użyte szczepy, z wyjątkiem Pseudomonas aeruginosa,wykazały się znaczną wrażliwością, przede wszystkim na TTO i terpinen-4-ol, ponieważ dla tych substancji uzyskane wartości MIC wahały się od 0,125 do 0,25%, a MBC od 0,25 do 0,5%. P-cymen okazał się nieaktywny w stosunku do wszystkich szczepów, ponieważ wartości MIC wyniosły powyżej 8%. W przypadku Pseudomonas aeruginosa jedynie terpinen-4-ol wykazał hamujące działanie w stężeniu 0,5%, natomiast pozostałe składniki TTO okazały się nieaktywne (MIC oraz MBC powyżej 8%).

Hammer i wsp. (14) porównywali aktywność składników TTO wobec grzybów z rodzajów: Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Candida, Rhodotorula, Aspergillus, Penicillium, Saccharomyces. Najwyższą przeciwgrzybiczą aktywnością wykazał się terpinen-4-ol i α-terpineol (wartości MIC od 0,008 do 0,25%). Dla dermatofitów uzyskano niższe wartości MIC w porównaniu z innymi grzybami.

Z klinicznego punktu widzenia bardzo cenne są badania porównawcze, określające wrażliwość drobnoustrojów na TTO w zestawieniu z wrażliwością tych drobnoustrojów na standardowe leki przeciwdrobnoustrojowe. Takie analizy przeprowadzono dla wybranych gatunków bakterii Gram-dodatnich oraz klinicznych szczepów grzybów, w tym szczepów opornych na najczęściej stosowane leki przeciwgrzybicze. Oliva i wsp. (37) ocenili wrażliwość klinicznych szczepów grzybów Candida spp. oraz Blastoschizomyces capitatus na standardowe leki przeciwgrzybicze: amfoterycynę B oraz 5-fluorocytozynę, a następnie na TTO i jego składniki: terpinen-4-ol, cyneol, terpinolen, α-terpinen, γ-terpinen. TTO oraz terpinen-4-ol wywierały najsilniejsze działanie przeciwgrzybicze. Wartości MIC dla tych substancji znajdowały się w przedziale od 0,03 do 0,25 μg/ml. Mniejszą aktywność wykazał cyneol, ponieważ wartości MIC tej substancji były w przedziale od 0,25 do 1,0 μg/ml. Dla pozostałych składników olejku wartości MIC wynosiły od 1 do ≥4 μg/ml. TTO i niektóre jego składniki wykazały silniejsze działanie niż amfoterycyna B oraz 5-fluorocytozyna, dla których uzyskano wartości MIC od 0,25 do ≥128 μg/ml.

Ergin i Arikan (26) badali wrażliwość na TTO wyizolowanych z pochwy szczepów Candida spp. wrażliwych oraz opornych na flukonazol. Po 24-godzinnej hodowli uzyskano wartości MIC TTO mieszczące się w przedziale od 0,25 do 4% (wartość średnia MIC wyniosła 2,2%), natomiast po 48-godzinnej hodowli uzyskano wartości MIC w przedziale od 1 do 8% (wartość średnia MIC wyniosła 3%). Profil wrażliwości badanego szczepu na flukonazol nie miał wpływu na uzyskane wartości MIC TTO.

W badaniach Traboulsi i wsp. (19) dla 91 szczepów Candida spp. (w tym 83 szczepy Candida albicans) wyizolowanych z jamy ustnej pacjentów zakażonych wirusem HIV, oznaczono wartości hamujące dla zestawu leków stosowanych w tego typu zakażeniach. Wartości MIC TTO dla wszystkich badanych szczepów były niskie i mieściły się w przedziale od 0,03 do 0,62%. Wartość MIC₅₀ wyniosła 0,07%, wartość MIC₉₀– 0,15%, a wartość MFC₉₀– 10% (MIC₅₀, MIC₉₀– to najmniejsze stężenie substancji hamujące wzrost drobnoustrojów odpowiednio: w 50% oraz w 90%, z kolei MFC₉₀ – to najmniejsze stężenie substancji grzybobójcze dla 90% szczepów). Identyczne wyniki uzyskano dla szczepów Candida albicans. Dla wszystkich zbadanych szczepów wartości MIC flukonazolu mieściły się w przedziale od 0,12 do 64,0 μg/ml. Wartość MIC₅₀ flukonazolu wyniosła 0,25 μg/ml, a wartość MIC₉₀ – 8,0 μg/ml. Dla szczepów Candida albicans uzyskano również te same wyniki. Z kolei dla 4 szczepów Candida spp. opornych na flukonazol wartości MIC TTO wyniosły od 0,07 do 0,15%.

W badaniach przeprowadzonych przez Bagg i wsp. (18) uzyskano niskie wartości MIC TTO dla szczepów Candida spp. opornych na flukonazol i itrakonazol. Ogółem zbadano 41 szczepów grzybów pochodzących od pacjentów z zaawansowaną chorobą nowotworową ( Candida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis oraz Saccharomyces cerevisiae). Dla ok. 49% tych szczepów wartości MIC TTO wyniosły 0,25%, dla ok. 34% szczepów – 0,5%, dla ok. 12% szczepów – 1,0%, a dla ok. 5% – 0,125%. Vazquez i wsp. (35) oznaczyli MIC TTO dla szczepów Candida albicans i Candida glabrata charakteryzujących się wysokimi wartościami MIC flukonazolu, tj. od 16 do 64 μg/ml. W grupie badanych szczepów uzyskano niskie wartości MIC TTO, a mianowicie od 0,06 do 0,5%.

Nenoff i wsp. (38) od pacjentów ze schorzeniami skórnymi (łupież, łupież pstry, zapalenie skóry, łojotokowe zapalenie skóry itp.) wyizolowali drobnoustroje z grupy dermatofitów: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, dla których uzyskano wartości MIC TTO w przedziale od 1,1 do 4,4 μg/ml, następnie szczepy Candida spp. z oznaczonymi wartościami MIC od 2,2 do 4,4 μg/ml oraz szczepy Malassezia furfur z wartościami MIC od 0,5 do 4,4 μg/ml. Dla porównania: MIC mikonazolu osiągnęło wartość dla dermatofitów od 0,1 do 0,78 μg/ml, dla Candida spp. od 0,1 do 6,25 μg/ml, a dla Malassezia furfur od 0,05 do 50,0 μg/ml.

Dla wybranych gatunków bakterii Gram-dodatnich ( Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis oraz Enterococcus faecalis) Hammer i wsp. (39) oznaczyli częstość występowania oporności na TTO oraz rifampicynę, a następnie porównano otrzymane wartości. Oporność na TTO zbadano dla różnych stężeń tego olejku. I tak: dla stężenia równego 1 x MIC TTO uzyskano częstość oporności w zakresie od 10⁰ do wartości poniżej 10^-10, dla stężenia równego 2 x MIC TTO uzyskano częstość oporności w zakresie od 10^-1 do wartości poniżej 10^-11, a dla stężenia równego 3 x MIC TTO uzyskano częstość oporności o wartości poniżej 10^-10. Oporność na rifampicynę występowała z większą częstością, albowiem analogiczny wskaźnik oznaczony dla stężenia rifampicyny równego 8 x MIC dla wszystkich zbadanych szczepów mieścił się w granicach od 10^-6 do 10^-8.

Mondello i wsp. (25) zainteresowali się TTO jako środkiem do stosowania w procesach dekontaminacji instalacji wodno-kanalizacyjnych wytwarzających aerozol wodno-powietrzny. Instalacje te są często zasiedlone bakteriami z rodzaju Legionella będącymi czynnikami etiologicznymi trudnych w leczeniu schorzeń, głównie zapalenia płuc (inaczej choroby legionistów) oraz gorączki Pontiac. Bakterie te stają się szczególnie niebezpieczne, jeżeli kolonizują instalacje szpitalne, ponieważ wówczas mogą stać się przyczyną powstania ciężkich zakażeń u pacjentów. Metodą mikrorozcieńczeniową oznaczono aktywność TTO wobec 22 szczepów Legionella pneumophila. Wśród wszystkich zbadanych szczepów należących do różnych grup serologicznych były zarówno szczepy wzorcowe, kliniczne, jak i wyizolowane ze środowiska szpitalnego. Uzyskano niskie wartości MIC TTO mieszczące się w przedziale od 0,125 do 0,5%. Natomiast wartości MBC były w zakresie od 0,5 do 1,0%.

Przeżywalność drobnoustrojów oraz kinetyka procesów mikrobójczych (krzywe time-kill)

Przeżywalność drobnoustrojów oraz kinetykę procesów mikrobójczych (krzywe time-kill) oceniano, eksponując zawiesinę szczepu drobnoustroju na wybrane stężenia TTO lub jego składników i obserwując przeżywalność komórek w wybranych odstępach czasowych. Redukcję liczebności drobnoustrojów określano w stopniach log₁₀ na jednostkę czasu. Przy użyciu tego rodzaju metod analizowano również czynniki wpływające na szybkość tych procesów. Uzyskane wyniki prezentowano na wykresach time-kill.

Carson wsp. (13) eksponowali szczep Staphylococcus aureus ATCC 9144 na TTO oraz jego składniki w różnych stężeniach. Dwugodzinna ekspozycja zawiesiny komórek na TTO w stężeniu 2 x MIC spowodowała redukcję ich liczebności o ok. 5 log₁₀, natomiast ekspozycja w stężeniu 1 x MIC – tylko o 1 log₁₀. Z kolei składnik olejku 1,8 – cyneol w stężeniu 2 x MIC lub 1 x MIC redukował liczbę komórek o 3 log₁₀. Po traktowaniu badanego szczepu gronkowca terpinen-4-olem i α-terpineolem w stężeniu 2 x MIC żywotność komórek obniżyła się o 7,5 log₁₀ i 6,5 log₁₀ odpowiednio po 9 i 30 min.

Cox i wsp. (16) ocenili aktywność TTO, terpinen-4-olu, γ-terpinenu, p-cymenu, 1,8-cyneolu oraz mieszanin: terpinen-4-ol z p-cymenem i terpinen-4-olem z γ-terpinenem w różnych stężeniach i czasach ekspozycji wobec wzorcowych szczepów: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans. Analiza wykresów time-kill wykazała, że użyte stężenia TTO najszybciej obniżały liczebność komórek Escherichia coli i Candida albicans. W stosunku do tych szczepów TTO, terpinen-4-ol oraz mieszaniny jego składników wykazały się podobną aktywnością. TTO oraz mieszaniny jego składników wykazały mniejszą niż terpinen-4-ol aktywność w stosunku do Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus a ureus. Ponadto porównywano aktywność 2 mieszanin: terpinen-4-olu z p-cymenem i terpinen-4-olu z γ-terpinenem z aktywnością każdego komponentu osobno. Zwiększoną aktywność przeciwdrobnoustrojową mieszanin w porównaniu z pojedynczymi składnikami stwierdzono tylko w stosunku do Escherichia coli i Candida albicans.

Wrażliwość klinicznych szczepów: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus na TTO była przedmiotem eksperymentu przeprowadzonego przez Hammer i wsp. (34). Po godzinnej ekspozycji na TTO liczebność dermatofitów ( Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes) zmniejszyła się o ok. 1 log₁₀. Szczepy Aspergillus niger i Aspergillus fumigatus były bardziej oporne, gdyż dopiero po 6-8-godzinnej ekspozycji na TTO liczebność komórek w stosunku do próby kontrolnej obniżyła się o ok. 1 log₁₀. Znaczną aktywność 1% TTO, 0,25% terpinen-4-olu, 0,5% i 1% 1,8-cyneolu wobec szczepu Candida albicans ATCC 10231 wskazały kolejne doświadczenia Hammera i wsp. (14), ponieważ substancje te już po 30 min działania spowodowały obniżenie żywotności komórek o ponad 3 log₁₀. W badaniach Mondello i wsp. (40) 1% TTO w czasie 30 minut lub 0,25% TTO w czasie 60 minut zabijał wyhodowane od pacjentów HIV-pozytywnych kliniczne szczepy Candida albicans oporne na flukonazol i itrakonazol.

Aktywność przeciwdrobnoustrojowa TTO Standard (zawierającego 34,8% terpinen-4-olu i 5,5% cyneolu) oraz TTO Clone 88 (zawierającego 43,1% terpinen-4-olu i 1,0% 1,8-cyneolu) wobec szpitalnych szczepów bakteryjnych o różnej oporności na antybiotyki była przedmiotem badań May i wsp. (41). Bakteriobójcze działanie TTO zdefiniowano jako redukcję liczby kolonii o 3 log₁₀ lub zabicie 99,9% komórek w wybranym czasie. Wszystkie badane szczepy Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium zostały zabite po czasie ok. 10 minut przez TTO Clone 88 i po ok. 60 minutach przez TTO Standard. Szczepy Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia oraz metycylinowrażliwe Staphylococcus aureus zostały zabite po ok. 30 minutach przez obydwa olejki. Natomiast metycylinooporne szczepy Staphylococcus aureus ginęły dopiero po 6 godzinach działania TTO Standard oraz po czasie od 1,5 do 3,5 godz. działania TTO Clone 88. TTO Standard nie spowodował eradykacji lekoopornych Pseudomonas aeruginosa nawet po 4 godzinach ekspozycji, natomiast większą aktywnością wobec tych bakterii wykazał się TTO Clone 88.

Wyznaczenie krzywych time-kill ułatwiało interpretację wyników uzyskanych w eksperymentach analizujących czynniki wpływające na antybakteryjną aktywność TTO lub jego składników. W badaniach Gustafson i wsp. (42) poszukiwano związku między fazą wzrostu bakterii Escherichia coli, a ich podatnością na TTO. Po 5 min traktowania zawiesiny komórek (będących w wykładniczej fazie wzrostu) TTO w stężeniu MBC nastąpił spadek ich liczebności o 7,46 log₁₀. Natomiast w analogicznych warunkach eksperymentu przeprowadzonego dla ww. szczepu w stacjonarnej fazie wzrostu liczebność spadła tylko o 3,53 log₁₀. Według badań Kwiecińskiego i wsp. (33) liczba zdolnych do życia komórek Staphylococcus aureus w wykładniczej fazie wzrostu była redukowana o 2 log₁₀ po czasie 60 min w warunkach ekspozycji bakterii na 0,5% TTO, podczas gdy działanie 8% TTO dało rezultat redukcji o 4 log₁₀. Z kolei liczba komórek w stacjonarnej fazie wzrostu była redukowana w ciągu 15 min o 1 log₁₀, zarówno po działaniu 0,5% TTO, jak i 8% TTO.

W badaniach innych autorów (15, 43) wyznaczono wykresy time-kill obrazujące spadki liczebności komórek bakteryjnych szczepu Pseudomonas aeruginosa poddanych działaniu tylko TTO, czy też jednego z jego składników lub poddanych działaniu jednej z tych substancji oraz dodatkowo eksponowanych wstępnie na polimyksynę B (PMBN), m-chlorofenyloydrazon (CCCP) lub kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Wstępna ekspozycja drobnoustrojów na powyższe substancje działające destrukcyjnie na błonę komórkową spowodowała uwrażliwienie komórek bakteryjnych na TTO i jego składniki. Szczep Pseudomonas aeruginosa będący w wykładniczej fazie wzrostu, wstępnie potraktowany PMBN, stał się bardziej wrażliwy na działanie TTO, γ-terpinenu, p-cymenu aniżeli ten sam szczep wyjściowy. Podobnie szczep będący w wykładniczej fazie wzrostu po wstępnym potraktowaniu CCCP stał się również bardziej wrażliwy na TTO i jego składniki. Przykładowo: liczebność komórek Pseudomonas aeruginosa po ekspozycji na CCCP oraz 0,25% TTO zmniejszyła się po 4 godzinach o 3 log₁₀ w porównaniu ze zmniejszeniem liczby komórek o 0,7 log₁₀ po działaniu samego 0,25% TTO. Liczebność komórek Pseudomonas aeruginosa w stacjonarnej fazie wzrostu potraktowanych EDTA oraz 0,25% TTO, po 30 minutach zmniejszyła się aż do poziomu poniżej progu wykrywalności, podczas gdy sam 0,25% TTO wykazał znikome działanie bakteriobójcze.

Mechanizmy oddziaływania TTO i jego składników na strukturę i funkcje życiowe komórek drobnoustrojów

Mechanizmy oddziaływania TTO i jego składników na strukturę i funkcje życiowe komórek drobnoustrojów szczegółowo nie zostały jeszcze poznane i opisane, jednakże według dotychczasowych doniesień aktywność przeciwdrobnoustrojowa TTO związana jest, przede wszystkim z modyfikacjami i niszczeniem funkcji błon biologicznych. Składniki TTO, będące związkami węglowodorowymi, wykazują właściwości lipofilne, lokują się pomiędzy acylowymi łańcuchami kwasów tłuszczowych tworzących podwójną warstwę lipidową błony komórkowej, co doprowadza do zaburzeń w upakowaniu lipidów, a następnie zmian właściwości i funkcjonowania błony w stopniu zależnym od lokalizacji składników olejku w warstwie lipidowej. Stężenia TTO niższe niż hamujące także zwiększają jej płynność (8). Powstałe uszkodzenia błony doprowadzają do wycieku cytoplazmy i jej koagulacji (1, 6, 44), wycieku jonów – zwłaszcza jonów K⁺ (40, 45, 46). Kinetykę zjawiska wycieku jonów K⁺ ( efflux K⁺) analizowano na przykładzie wzorcowych szczepów drobnoustrojów z użyciem selektywnych elektrod. Oddziaływanie TTO na komórki Escherichia coli badał Cox i wsp. (45). Z komórek tego szczepu, będących w wykładniczej lub stacjonarnej fazie wzrostu, wyciek K⁺ rozpoczął się już po 1 min po dodaniu TTO w stężeniu 0,25% i 0,5%. Tempo wycieku K⁺ dla obydwu użytych stężeń olejku było jednak wolniejsze w stacjonarnej fazie wzrostu w porównaniu z wykładniczą fazą wzrostu komórek. Inne badania prowadzone w tym samym ośrodku wykazały, że wyciek K⁺ z komórek Escherichia coli rozpoczął się natychmiast po dodaniu TTO, a po 30 minutach występował prawie w 100% komórek. Wyciek jonów K⁺ z komórek Staphylococcus aureus poddanych działaniu TTO został z kolei opisany przez Hada i wsp. (46). Zjawisko to wystąpiło natychmiast po dodaniu TTO do zawiesiny bakterii, po czym stężenie K⁺ osiągnęło plateau. Nasilenie wycieku występowało zwłaszcza w pierwszych 10 sekundach ekspozycji i było proporcjonalne do użytych stężeń TTO. W badaniach Cox i wsp. (45) traktowanie zawiesiny Staphylococcus aureus 0,25% TTO spowodowało wyciek K⁺ z komórek już po 5 minutach, a po 30 minutach utracony potas osiągnął wartość 20% całkowitej ilości komórkowej. Natomiast efflux w przypadku komórek szczepu Candida albicans rozpoczął się dopiero po dwugodzinnej ekspozycji na TTO.

W badaniach Harkenthal i wsp. (44) założono, że wskaźnikiem wzrostu przepuszczalności błony po ekspozycji na TTO był wzrost zewnątrzkomórkowej aktywności dehydrogenazy mleczanowej – enzymu utleniającego mleczan do pirogronianu oraz redukującego NAD⁺ do NADH. W supernatancie uzyskanym z hodowli Mycoplasma pneumoniae po traktowaniu TTO stwierdzono 10-krotny wzrost aktywności tego enzymu w porównaniu z supernatantem z hodowli nietraktowanej TTO.

W badaniach przepuszczalności błon komórkowych drobnoustrojów Cox i wsp. (45) wykorzystali jodek propidyny penetrujący komórki z uszkodzoną błoną i wybarwiający jej kwas nukleinowy. Po 30 minutach ekspozycji zawiesin Escherichia coli, Staphylococcus aureus i Candida albicans na 0,25% TTO stwierdzili wzrost przepuszczalności komórkowej uwidoczniony fluorescencją zabarwionego jodkiem propidyny kwasu nukleinowego. Zawiesiny kontrolne drobnoustrojów bez dodatku TTO nie dały efektu wybarwienia.

Zaobserwowano także zjawisko rozpadu komórek po zadziałaniu TTO lub jego składników, które mierzono spektofotometrycznie lub metodami mikroskopowymi. Gustafson i wsp. (42) badali zjawisko stymulowania autolizy komórek szczepu Escherichia coli AG-100 będących w wykładniczej bądź stacjonarnej fazie wzrostu, po dodaniu do zawiesin komórek TTO w stężeniu 1 x MBC. Po 4-godzinnej ekspozycji nastąpiło obniżenie wartości początkowej absorbancji o 63% oraz o 23%, odpowiednio dla komórek w wykładniczej oraz stacjonarnej fazie wzrostu. Dla zawiesin kontrolnych, nie poddanych działaniu TTO, spadek absorbancji po 4-godzinnej ekspozycji na TTO wyniósł 13,9% dla fazy wzrostu wykładniczego i 10% dla fazy stacjonarnej. Spadek absorbancji był zależny od żywotności szczepu, bowiem większą wrażliwością na TTO odznaczały się komórki w fazie wykładniczej w porównaniu z komórkami w fazie stacjonarnej.

Carson i wsp. (13) przeprowadzili pomiary gęstości optycznej (OD) zawiesin szczepu Staphylococcus aureus traktowanych kolejno: TTO, terpinen-4-olem, α-terpineolem i 1,8-cyneolem w czasie od 30 sekund do 23 godzin. Znaczące obniżenie wartości OD w porównaniu z wartością OD czasu zerowego odnotowano dla prób traktowanych przez 23 godziny składnikami TTO: terpinen-4-olem i α-terpineolem.

W eksperymentach Hammer i wsp. (8) wskaźnikami aktywności przeciwgrzybiczej TTO i jego składników wobec komórek Candida albicans, Candida glabrata i Saccharomyces cerevisiae poddanych ekspozycji na te substancje był procentowy wzrost wybarwionych błękitem metylenowym komórek drobnoustrojów oceniany metodami mikroskopowymi, wzrost intensywności fluorescencji badanego materiału oraz zjawisko hamowania zakwaszania podłoża.

Cox i wsp. (45) badali zjawisko inhibicji oddychania komórkowego drobnoustrojów w wyniku eksponowania zawiesin szczepów na TTO w różnych stężeniach oraz różnych fazach wzrostu hodowli. Przy użyciu tlenowych elektrod mierzono szybkość glukozozależnego oddychania komórek Escherichia coli poddawanych działaniu TTO. W obecności 0,5% TTO oddychanie w wykładniczej fazie wzrostu zostało całkowicie zahamowane. W stacjonarnej fazie wzrostu tempo inhibicji było wolniejsze i po 5 minutach ekspozycji na 1% TTO szybkość zużycia tlenu stanowiła 43% wartości próby kontrolnej. W analogicznych badaniach poddano eksperymentowi inne drobnoustroje. Inhibicja oddychania komórkowego dla Candida albicans rozpoczęła się po 5 minutach ekspozycji na TTO w stężeniu 0,125%, a dla Staphylococcus aureus po 10 minutach ekspozycji na TTO w stężeniu 0,5%.

Technika mikroskopii elektronowej

Technikę mikroskopii elektronowej wykorzystano do badania wpływu TTO i jego składników na komórki drobnoustrojów: terpinen-4-olu na strukturę komórek Staphylococcus aureus ATCC 9144 (13) i Pseudomonas aeruginosa NCTC 1062 (15), TTO na komórki Escherichia coli AG 100 (42), Pseudomonas aeruginosa NCTC 1062 (15) oraz komórki dzikich szczepów Mycoplasma pneumoniae (44). Zawiesiny drobnoustrojów po ekspozycji na badaną substancję w wybranym czasie i stężeniu odwirowywano, utrwalano i barwiono, po czym poddawano analizie mikroskopowej. Badania przeprowadzone przez Carsona i wsp. (13) wykazały, że 0,3% terpinen-4-ol powodował zmiany w strukturze niektórych komórek Staphylococcus aureus. W części z nich pojawiły się tzw. multilamellarne struktury mezosomopodobne, a zawartość niektórych komórek stała się amorficzna. Z kolei w innych eksperymentach (15) zaobserwowano, że 2% terpinen-4-ol po 10 minutach oddziaływania na komórki Pseudomonas aeruginosa jeszcze nie powoduje zmian strukturalnych, natomiast po 60 minutach w komórkach można wykazać obecność elektronorzadkich inkluzji. W komórkach tej bakterii traktowanej 4% TTO zaobserwowano natomiast zaburzenia w strukturze błony zewnętrznej, nie stwierdzono jednak obecności inkluzji. Metodą mikroskopową z użyciem specjalnych technik barwienia badano wpływ wybranych stężeń TTO na utworzoną w warunkach in vitro strukturę biofilmu Staphylococcus aureus (33). Efektywna eradykacja biofilmu wystąpiła w przypadku działania 1% TTO w czasie 24 godzin, przy czym najszybsze usuwanie biofilmu zaobserwowano w ciągu pierwszych 15 minut od kontaktu z TTO. Metody mikroskopowe do oceny oddziaływania TTO na komórki drobnoustrojów zastosował także Gustafson i wsp. (42). W badaniach tych TTO w stężeniu 0,5 x MBC lub równym MBC dodany do zawiesiny komórek Escherichia coli powodował koagulację składników cytoplazmy, pojawienie się skupisk pozakomórkowych pęcherzyków i utratę gęstości elektronowej materiału. Po godzinnym traktowaniu komórek tego szczepu TTO w stężeniu równym MBC nie stwierdzono żywych komórek, a kilka martwych komórek wykazywało nieuszkodzone błony i ściany. Badania Harkenthal i wsp. (44) wykazały, że po traktowaniu TTO zawiesin dzikich szczepów Mycoplasma pneumoniae komórki tych drobnoustrojów przyjmowały kształt okrągły bądź owalny, podczas gdy nietraktowane komórki charakteryzowały się zwykle różnorodnymi kształtami.

Aktywność przeciwdrobnoustrojową TTO sporadycznie oceniano również innymi metodami niż opisane powyżej. Przykładem są badania Hammera i wsp. (47), którzy interesowali się hamującym działaniem TTO na powstanie formy pseudostrzępkowej (germ tube) Candida albicans z pierwotnej formy drożdżakowej (taką zdolność wykazuje gatunek Candida albicans po inkubacji w surowicy krwi). Wykazano, że po 4-godzinnej ekspozycji komórek grzybów na 0,031% TTO średni odsetek form germ tube mieścił się w przedziale od 10,0 do 68,5%, podczas gdy dla próby nieeksponowanej (czyli kontrolnej) wynosił od 91,0 do 100,0%.

Przeciwwirusową aktywność TTO badał Schnitzler i wsp. (21). Linię komórkową RC-37 nerki afrykańskiej małpy zielonej, uprzednio traktowaną różnymi stężeniami TTO, zainfekowano zawiesinami wirusów opryszczki HSV-1 i HSV-2, a następnie po 4 dniach zliczono łysinki i obliczono wartości IC 50 (IC 50 to stężenie olejku powodujące redukcję wirusów o 50% w porównaniu z kontrolą). Uzyskano niskie wartości IC 50, tj. 0,009% dla HSV-1 oraz 0,008% dla HSV-2. Tą metodą porównywano również siłę oddziaływania TTO na szczepy wirusów opryszczki w różnych fazach rozwojowych: przed zakażeniem komórek hodowli linii RC-37, w trakcie adsorpcji oraz po penetracji wirusów do tych komórek. Najwyższym stopniem redukcji łysinek, czyli największą siłę antywirusową wykazał TTO, kiedy oddziaływał na wolne cząstki wirusów opryszczki (tzn. będące przed lub w trakcie fazy adsorpcji). Po fazie penetracji cząstek wirusów do komórek olejek nie wykazywał aktywności przeciwwirusowej.

Nie można pominąć w niniejszym opracowaniu prezentacji wyników badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej TTO przeprowadzonych in vivo na zakażonych zwierzętach. Mondello i wsp. (40) zakazili pochwę szczurów szczepami Candida albicans opornymi lub wrażliwymi na flukonazol. Po 1, 24 i 48 godzinach od momentu zakażenia podawano dopochwowo TTO w stężeniu 1%, 2,5% i 5%. Kontrolę stanowiły szczury, które otrzymywały flukonazol. Przebieg zakażenia po podaniu ww. preparatów monitorowano przez 21 dni, zliczając w odstępach czasu wyrosłe kolonie z posiewów popłuczyn pochwy. Aplikacja dopochwowa TTO spowodowała znacznie szybszą redukcję liczebności komórek drożdżaków niż w przypadku podawania flukonazolu. Uzyskane efekty leczenia były proporcjonalne do użytych dawek TTO.

Zastosowanie znormalizowanych metod do badań właściwości TTO

Z uwagi na brak norm zawierających wytyczne do oceny in vitro aktywności przeciwdrobnoustrojowej olejków eterycznych, badania TTO wykonywano według własnych metod badawczych, opracowanych w laboratoriach naukowych. W najwcześniejszych doniesieniach opisywano jakościowe agarowe metody dyfuzyjne, natomiast w okresie późniejszym coraz częściej stosowano metodyki oparte na wytycznych norm międzynarodowych NCCLS ( ang. – National Committee for Clinical Laboratory Standards) opisujących ilościowe metody rozcieńczeniowe wyznaczania wartości bakteriostatycznych lub bakteriobójczych badanej substancji – odrębnie dla bakterii i grzybów.

W Polsce zastosowanie praktyczne mają normy europejskie, które uzyskały już status norm polskich. Po dokonaniu niezbędnych modyfikacji mogą one być zastosowane do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej TTO. Norma PN-EN ISO 20776: 2007 – część 1 i 2 (48, 49) opisuje ilościową mikrorozcieńczeniową metodę oznaczania najmniejszych stężeń leku (wartości MIC) hamujących wzrost bakterii oraz określa przydatność gotowych testów do oznaczania wrażliwości bakterii na leki. Z kolei normy: PN-EN 1040:2006 (50) oraz PN-EN 1275:2006 (51) zawierają wytyczne ilościowej zawiesinowej metody określania podstawowego działania bójczego środka antyseptycznego lub dezynfekcyjnego (odpowiednio dla bakterii i grzybów) oraz opisują sposób badania kinetyki procesów bójczych w zależności od stężenia środka i czasu jego oddziaływania.

Podsumowanie

Tea Tree Oil (TTO) pozyskiwany z rośliny Melaleuca alternifolia jest wieloskładnikową mieszaniną o właściwościach antyseptycznych. Obecnie wzrasta zainteresowanie tą substancją pochodzenia naturalnego. Prowadzone są liczne badania in vitro oceniające jej skuteczność przeciwdrobnoustrojową. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa TTO i jego składników jest związana, przede wszystkim z niszczeniem funkcji błon biologicznych komórek drobnoustrojów poddanych ekspozycji na te substancje. Dominującą metodą badania aktywności TTO wobec drobnoustrojów jest ilościowa metoda rozcieńczeniowa pozwalająca wyznaczać wartości bakteriostatyczne MIC oraz bakteriobójcze MBC. Uzyskane w licznych badaniach wartości MIC TTO i jego składników wskazują na ogólnie wysoką wrażliwość wszystkich grup drobnoustrojów na badane substancje. Znaczącą wrażliwością na TTO odznaczają się także szczepy drobnoustrojów oporne na stosowane leki przeciwdrobnoustrojowe. Nie występuje więc zjawisko krzyżowej oporności TTO z konwencjonalnymi lekami. Metoda oznaczania przeżywalności drobnoustrojów eksponowanych na TTO i jego składniki oraz wyznaczanie krzywych time-kill pozwala monitorować kinetykę procesów zabijania drobnoustrojów oraz analizować czynniki wpływające na te procesy. Inne metody badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej olejku i jego składników, jako opisywane sporadycznie, mają mniejsze znaczenie praktyczne.

Piśmiennictwo

1. Kędzia A, Ostrowski-Meissner H, Kędzia AW. Działanie olejku z drzewa herbacianego na bakterie beztlenowe wyhodowane z zakażeń dróg oddechowych. Post Fitoter 2004; 4:158-62. 2. Kędzia B, Alkiewicz J, Han S. Znaczenie olejku z drzewa herbacianego w fitoterapii. Cz. I. Skład olejku i jego właściwości biologiczne. Post Fitoter 2000; 2:36-40. 3. Konopacka-Brud I. Olejek z drzewa herbacianego (Melaleuca alternifolia). Aromater 1995; 2:5-9. 4. Alkiewicz J, Kędzia B, Hołderna-Kędzia E i wsp. Badania nad działaniem olejku z drzewa herbacianego (Melaleuca alternifolia) na bakterie górnych dróg oddechowych. Post Aerozoloter 1995; 3:141-8. 5. Dymowski W. Olejek z Tea Tree Oil. Wiad Ziel 1995; 2:11-3. 6. Carson CF, Hammer KA, Riley TV. Melaleuca alternifolia (Tea Tree) oil: a review of antimicrobial and other medicinal properties. Clin Microbiol Rev 2006; 19:50-62. 7. Caelli M, Porteous J, Carson CF i wsp. Tea Tree Oil as an alternative topical decolonization agent for methicillin – resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect 2000; 46:236-7. 8. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antifungal effects of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and its components on Candida albicans, Candida glabrata and Saccharomyces cerevisiae. J Antimicrob Chemother 2004; 53:1081-5. 9. D'Auria FD, Laino L, Strippoli V i wsp. In vitro activity of tea tree oil against Candida albicans mycelial conversion and other pathogenic fungi. J Chemother 2001; 13:377-83. 10. Brud WS, Chrząszcz M. Olejki eteryczne jako naturalne konserwanty. Aromater 1998; 4:20-6. 11. Kędzia B, Alkiewicz J, Han St. Znaczenie olejku z drzewa herbacianego w fitoterapii. Cz II. Zastosowanie lecznicze. Post Fitoter 2000; 3:33-7. 12. Vazquez JA, Zawawi AA. Efficacy of alcohol – based and alcohol-free melaleuca oral solution for the treatment of fluconazole-refractory oropharyngeal candidiasis in patients with AIDS. HIV Clin Trials 2002; 3:379-85. 13. Carson CF, Mee BJ, Riley TV. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time- kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1914-20. 14. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antifungal activity of the components of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. J Appl Microbiol 2003; 95:853-60. 15. Longbottom CJ, Carson CF, Hammer KA i wsp. Tolerance of Pseudomonas aeruginosa to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil is associated with the outer membrane and energy – dependent cellular processes. J Antimicrob Chemother 2004; 54:386- 92. 16. Cox SD, Mann CM, Markham JL. Interactions between components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Appl Microbiol 2001; 91:492-7. 17. Jandourek A, Vaishampayan JK, Vazquez JA. Efficacy of melaleuca oral solution for the treatment of fluconazole refractory oral candidiasis in AIDS patients. AIDS 1998; 12:1033-7. 18. Bagg J, Jackson MS, Sweeney MP i wsp. Susceptibility to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil of yeasts isolated from the mouths of patients with advanced cancer. Oral Oncol 2006; 42:487-92. 19. Traboulsi RS, Mukherjee PK, Ghannoum MA. In vitro activity of inexpensive topical alternatives against Candida spp. isolated from the oral cavity of HIV – infected patients. Int J Antimicrob Agents 2008; 31:272-6. 20. Alkiewicz J, Kędzia B, Zawadzka D i wsp. Badania aktywności mikrobiologicznej olejku z drzewa herbacianego i próby jego zastosowania w terapii inhalacyjnej. Post Aerozoloter 1998; 6:115-23. 21. Schnitzler P, Schön K, Reichling J. Antiviral activity of Australian tea tree oil and eucalyptus oil against herpes simplex virus in cell culture. Pharmazie 2001; 56:343-7. 22. Carson CF, Ashton L, Dry L i wsp. Melaleuca alternifolia (tea tree) oil gel (6%) for the treatment of recurrent herpes labialis. J Antimicrob Chemother 2001; 48:450-1. 23. Van Kessel K, Assefi N, Marrazzo J i wsp. Common complementary and alternative therapies for yeast vaginitis and bacterial vaginosis: a systematic review. Obstet Gynecol Surv 2003; 58:351-8. 24. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. In vitro susceptibilities of Lactobacilli and organisms associated with bacterial vaginosis to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:196. 25. Mondello F, Girolamo A, Scaturro M i wsp. Determination of Legionella pneumophila susceptibility to Melaleuca alternifolia Cheel (tea tree) oil by an improved broth micro- dilution method under vapour controlled conditions. J Microbiol Methods 2009; 77:243-8. 26. Ergin A, Arikan S. Comparison of microdilution and disc diffusion methods in assessing the in vitro activity of fluconazole and Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against vaginal Candida isolates. J Chemother 2002; 14:465-72. 27. Edwards-Jones V, Buck R, Shawcross SG. The effect of essential oils on methicillin – resistant Staphylococcus aureus using a dressing model. Burns 2004; 30:772-7. 28. Carson CF, Riley TV. Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Appl Bacteriol 1995; 78:264-9. 29. Rosato A, Vitali C, Gallo D i wsp. The inhibiton of Candida species by selected essential oils and their synergism with amphotericin B. Phytomedicine 2008; 15:635-8. 30. Hinou JB, Harvala CE, Hinou EB. Antimicrobial activity screening of 32 common constituents of essential oils. Pharmazie 1989; 44:H4, 302-3. 31. Banes-Marshall L, Cawley P, Phillips CA. In vitro activity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against bacterial and Candida spp. isolates from clinical specimens. Br J Biomed Sci 2001; 58:139-45. 32. Elsom GKF, Hide D. Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to tea tree oil and mupirocin. J Antimicrob Chemother 1999; 43:427-8. 33. Kwieciński J, Sigrun E, Wójcik K. Effects of tea tree (Melaleuca alternifolia) oil on Staphylococcus aureus in biofilms and stationary growth phase. Int J Antimicrob Agents. 2009; 33:343-7. 34. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. In vitro activity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against dermatophytes and other filamentous fungi. J Antimicrob Chemother 2002; 50:195-9. 35. Vazquez JA, Arganoza MT, Boikov D i wsp. In vitro susceptibilities of Candida and Aspergillus species to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Rev Iberoam Micol 2000; 17:60-3. 36. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. In vitro activity of essential oils, in particular Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and tea tree oil products, against Candida spp. J Antimicrob Chemother 1998; 42:591-5. 37. Oliva B, Piccirilli E, Ceddia T i wsp. Antimycotic activity of Melaleuca alternifolia essential oil and its major components. Lett in Appl Microbiol 2003; 37:185-7. 38. Nenoff P, Haustein U-F, Brandt W. Antifungal activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) against pathogenic fungi in vitro. Skin Pharmacol 1996; 9:388-94. 39. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Frequencies of resistance to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and rifampicin in Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Enterococcus faecalis. Int J Antimicrob Agents 2008; 32:170-3. 40. Mondello F, De Bernardis F, Girolamo A i wsp. In vitro and in vivo activity of tea tree oil against azole-susceptible and resistant human pathogenic yeasts. J Antimicrob Chemother 2003; 51:1223-9. 41. May J, Chan CH, King A i wsp. Time-kill studies of tree oils on clinical isolates. J Antimicrob Chemother 2000; 45:639-43. 42. Gustafson JE, Liew YC, Chew S i wsp. Effects of tea tree oil on Escherichia coli. Lett Appl Microbiol 1998; 26:194-8. 43. Mann CM, Cox SD, Markham JL. The outer membrane of Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749 contributes to its tolerance to the essential oil Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Lett Appl Microbiol 2000; 30:294-7. 44. Harkenthal M, Layh-Schmitt G, Reichling J. Effect of Australian tea tree oil on the viability of the wall-less bacterium Mycoplasma pneumoniae. Pharmazie 2000; 55:380-4. 45. Cox SD, Gustafson JE, Mann CM i wsp. Tea tree oil causes K⁺ leakage and inhibits respiration in Escherichia coli. Lett Appl Microbiol 1998; 26;355-8. 46. Hada T, Inoue Y, Shiraishi A i wsp. Leakage of K⁺ ions from Staphylococcus aureus in response to tea tree oil. J Microbiol Methods 2003; 53:309-12. 47. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Melaleuca alternifolia (tea tree) oil inhibits germ tube formation by Candida albicans. Medical Mycol 2000; 38:355-62. 48. PN-EN ISO 20776-1: 2007 Kliniczne badania laboratoryjne i metody badań diagnostycznych in vitro – Oznaczanie wrażliwości drobnoustrojów i ocena przydatności gotowych testów do oznaczania wrażliwości na leki przeciwbakteryjne. Część 1: Referencyjna metoda oznaczania in vitro aktywności leków przeciwbakteryjnych wobec szybko rosnących tlenowych bakterii wywołujących choroby zakaźne. 49. PN-EN ISO 20776-2: 2007 Kliniczne badania laboratoryjne i metody badań diagnostycznych in vitro – Oznaczanie wrażliwości drobnoustrojów i ocena przydatności gotowych testów do oznaczania wrażliwości na leki przeciwbakteryjne. Część 2: Ocena przydatności gotowych testów do oznaczania wrażliwości na leki przeciwbakteryjne. 50. PN–EN 1040:2006 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne. Ilościowa zawiesinowa metoda określania podstawowego działania bakteriobójczego chemicznych środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych. Metoda badania i wymagania (faza I). 51. PN-EN 1275:2006 Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne. Ilościowa zawiesinowa metoda określania podstawowego działania grzybobójczego lub podstawowego działania bójczego wobec grzybów drożdżopodobnych, chemicznych środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych. Metoda badania i wymagania (faza I). 52. van Wyk BE, Wink M: Rośliny lecznicze świata. MedPharm Polska 2008; s. 202, wyd. I polskie.

otrzymano/received: 2010-01-22
zaakceptowano/accepted: 2010-02-04

Adres/address:
*Anna Mertas
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii ŚUM
ul. Jordana 19, 41-808 Zabrze
tel./fax: (32) 272-25-54
e-mail: amertas@sum.edu.pl

Artykułu Przegląd badań in vitro oceniających aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku z drzewa herbacianego ( Tea Tree Oil). Cz. I w Czytelni Medycznej Borgis.

Przegląd badań in vitro oceniających aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku z drzewa herbacianego ( Tea Tree Oil). Cz. I