Ocena aktywności antybiotycznej wyciągów roślinnych

W ostatnich latach obserwuje się wyraźny wzrost zainteresowania świata medycznego lekiem roślinnym jako alternatywą wobec nadużywania w lecznictwie antybiotyków i w związku z tym powstawania szczepów drobnoustrojów opornych na ich działanie. Liczne doniesienia naukowe coraz częściej wiążą patomechanizm wielu chorób wewnętrznych i zewnętrznych z czynnikiem etiologicznym, jakim są drobnoustroje, zarówno bakterie, grzyby, jak i wirusy chorobotwórcze dla człowieka. Stąd wynikają poszukiwania nowych, skutecznych preparatów leczniczych opartych na aktywnych antybiotycznie surowcach roślinnych. Są one możliwe dzięki współpracy badaczy z dziedziny botaniki, fitochemii, medycyny i mikrobiologii.

Wieloletnie badania własne prowadzone w Instytucie Roślin i Przetworów Zielarskich, a od stycznia 2009 r. w Instytucie Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu, poparte danymi piśmiennictwa wskazują na istotną rolę roślin i sporządzonych z nich wyciągów, tak w podwyższaniu odporności organizmu na zakażenia, jak i poprzez bezpośrednie niszczące oddziaływanie na komórki drobnoustrojów chorobotwórczych. W tym kontekście w poprzedniej pracy (1) poddano badaniom skriningowym wobec szczepu standardowego gronkowca złocistego 135 surowców zielarskich pochodzenia krajowego i zagranicznego, z których sporządzono łącznie 405 wyciągów lipofilnych i hydrofilnych. Analizując uzyskane wartości aktywności antybiotycznej badanych wyciągów, wyodrębniono grupy wyciągów o wysokiej, średniej i niskiej aktywności. W poprzedniej pracy (1) przeanalizowano także dane piśmiennictwa, które wskazują na szeroki zakres aktywności przeciwdrobnoustrojowej badanych wyciągów.

W niniejszej pracy postanowiono kontynuować przegląd oznaczeń aktywności antybiotycznej dla kolejnych wyciągów roślinnych pozyskanych w większości z surowców zielarskich rodzimego pochodzenia, mając nadzieję na odkrycie dalszych wyciągów roślinnych o wyjątkowo silnym działaniu na drobnoustroje.

Badaniami prowadzonymi na przestrzeni 30 lat objęto 387 suchych i zagęszczonych wyciągów roślinnych otrzymanych z 74 roślin zielarskich różnego pochodzenia. W wielu przypadkach wyciągi sporządzano z różnych części tej samej rośliny (kwiat, liść, igły, ziele, cała roślina, plecha, owoc, cebula, nasiona, kiełki, korzeń, korzeń i liść, słoma, plewy, ziarno). Analizowane surowce ekstrahowano w stosunku 1:10 za pomocą rozpuszczalników o różnej polarności, w tym wody (54 wyciągi), metanolu (35 wyciągów), etanolu (207 wyciągów), butanolu (7 wyciągów), chlorku metylenu (14 wyciągów), octanu etylu (14 wyciągów), acetonu (6 wyciągów), eteru etylowego (9 wyciągów), eteru naftowego (7 wyciągów), chloroformu (5 wyciągów), heptanu (7 wyciągów) i heksanu (20 wyciągów). Rośliny zielarskie poddane badaniom i otrzymane z nich wyciągi zestawiono w tabeli 1. Wynika z niej, że do przygotowania wyciągów wodnych użyto 25 surowców zielarskich, wyciągów metanolowych – 24 surowce, wyciągów etanolowych – 46 surowców, butanolowych – 3 surowce, natomiast do sporządzenia wyciągów przy użyciu chlorku metylenu wykorzystano 5 surowców, octanu etylu i eteru etylowego – po 8 surowców, acetonu i chloroformu – po 4 surowce, eteru naftowego i heptanu – po 2 surowce oraz heksanu – 14 surowców zielarskich.

Badania skriningowe prowadzono z użyciem wrażliwego na substancje antybiotyczne międzynarodowego szczepu standardowego Staphylococccus aureus ATCC 6538 P. Wyciągi rozpuszczano w DMSO w stężeniu 100 mg/ml i przygotowywano z nich rozcieńczenia w płynnym podłożu Antibiotic Medium (Merck) w stężeniach od 0,01 do 10,0 mg/ml. W razie potrzeby przygotowywano dodatkowo roztwory badanych wyciągów w DMSO w stężeniu 1000 mg/ml, z których sporządzano roztwory w podłożu Antibiotic Medium w granicach stężeń od 10 do 100 mg/ml. Podobnie w razie potrzeby przygotowywano roztwory wyciągów w podłożu Antibiotic Medium w granicach stężeń od 0,0005 do 0,01 mg/ml. Do odpowiednich rozcieńczeń wyciągów o objętości 1 ml dodawano po 0,1 ml 18-godzinnej hodowli szczepu standardowego, zawierającej 10⁵ komórek w 1 ml. Posiewy inkubowano przez okres 24 godz. w temp. 37°C. Następnie określano najmniejsze stężenia hamujace (MIC – Minimal Inhibitory Concentration) badanych wyciągów wobec szczepu standardowego. Jako substancji referencyjnej użyto chloramfenikolu.

Wyniki oznaczeń aktywności antybiotycznej 387 wyciągów roślinnych otrzymanych z 74 roślin zielarskich za pomocą rozpuszczalników o różnej polarności przedstawiono w tabelach 2-7. Podano w nich zakres i średnie wartości MIC dla wszystkich analizowanych grup wyciągów otrzymanych przy użyciu rozpuszczalników o różnej polarności.

Analizując wartości MIC badanych wyciągów i przyjmując jako kryterium wysokiej aktywności antybiotycznej MIC ≤ 0,01 mg/ml, wyodrębniono 17 wyciągów roślinnych otrzymanych przy użyciu różnych rozpuszczalników (tab. 8). Wsród badanych wyciągów jeden ekstrahowano wodą, trzy metanolem, dwa etanolem, jeden chlorkiem metylenu, dwa octanem metylu, dwa acetonem, dwa eterem etylowym, dwa heptanem i dwa heksanem. Natomiast wśród wyciągów ekstrahowanych butanolem, eterem naftowym i chloroformem nie stwierdzono wyciągów wysoce aktywnych. W grupie omawianych wyciągów najwyższą aktywnością odznaczały się wyciągi z plechy Cladonia uncialis otrzymane przy użyciu acetonu, eteru etylowego, heptanu i metanolu (MIC=0,0005-0,01 mg/ml). Wysoką aktywnością charakteryzowały się również wyciągi z korzeni Salvia miltiorrhiza otrzymane za pomocą octanu etylu i heksanu (MIC=0,01 mg/ml). Nieco niższą aktywność wykazywały wyciągi: metanolowy z Usnea barbata, wyciąg otrzymany przy użyciu eteru etylowego z plechy Parmelia sulcata i heksanowy z korzeni Lithospermum canescens (MIC=0,025 mg/ml). Celem podsumowania aktywności antybiotycznej wszystkich badanych wyciągów roślinnych podano dane zbiorcze, zebrane w tabeli 9. Przedstawiono w niej zakres i średnie wartości MIC dla wszystkich analizowanych grup wyciągów otrzymanych przy użyciu rozpuszczalników o różnej polarności. Najniższa oznaczona wartość MIC wyrażona w mg/ml należała do grupy wyciągów acetonowych, wynosiła ona 0,0005 mg/ml i świadczyła ona o bardzo wysokiej aktywności antybiotycznej, natomiast najwyższą wartość MIC rzędu 100 mg/ml stwierdzono wśród wyciągów wodnych, przy czym wskazywała ona na bardzo niską aktywność tych wyciągów. Średnie wartości aktywności antybiotycznej (wyrażone w postaci MIC) kształtowały się na poziomie od 0,4 mg/ml dla 9 wyciągów otrzymanych przy użyciu eteru etylowego do 15,5 mg/ml dla 54 wyciągów wodnych. Należy dodać, że do bardzo aktywnych antybiotycznie wyciągów należały również wyciągi otrzymane za pomocą eteru naftowego (średnia wartość MIC=1,7 mg/ml). Średnie wartości MIC dla pozostałych grup wyciagów mieściły się w granicach od 2,5 do 5,0 mg/ml.

1. Spośród 387 badanych wyciągów roślinnych sporządzonych przy użyciu 12 rozpuszczalników wyodrębniono 17 wyciągów o wysokiej aktywności antybiotycznej (MIC ≤ 0,1 mg/ml).

2. W grupie wyciągów o wysokiej aktywności antybiotycznej przeważały wyciągi otrzymane przy użyciu acetonu, eteru etylowego, heptanu i metanolu z plechy Cladonia uncialis oraz wyciągi uzyskane za pomocą octanu etylu i heksanu z korzeni Salvia miltiorrhiza.

3. Najaktywniejszą grupą okazały się wyciągi otrzymane przy użyciu eteru etylowego i naftowego (średnia wartość MIC wynosiła odpowiednio 0,4 i 1,7 mg/ml), natomiast najmniej aktywną grupą okazały się wyciągi wodne (średnia wartość MIC=15,5 mg/ml).

4. Wyciągi o najwyższej aktywności antybiotycznej mogą stanowić potencjalne źródło środków do leczenia chorób zewnętrznych o etiologii drobnoustrojowej.