© Borgis - Postepy Fitoterapii 1, s. 9-12
*Anna Kędzia
Ocena wrażliwości na olejek cedrowy ( Oleum Cedri) grzybów drożdżopodobnych
Evaluation of the susceptibility to cedar oil (Oleum Cedri) yeastlike fungi
Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej, Katedra Mikrobiologii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Zakładu i Katedry: dr hab. Anna Kędzia, prof. nadzw.
Summary
The sensitivity to cedar oil 63 strains of yeastlike fungi isolated from patients with infections of oral cavity or respiratory tract and 6 references strains were investigated. The susceptibility of Candida strains was determined by the plate dilution technique in Sabouraud agar. The inoculum contained 106 CFU per spot. The agar plates containing appropriate oil concentrations and without oil (fungi strains growth control) were inoculated using a Steers replicator. Incubation the plates was conducted in 37°C in aerobic conditions for 24 hours. The MIC was defined as the lowest concentrations of the cedar oil completely inhibiting the growth of yeastlike fungi. The results showed, that most susceptible to essential oil in ranges = 3,1-25,0 mg/ml were the strains from genus of Candida parapsilosis and C. utilis. Among fungi species, the strains from the genus of C. guilliermondii, C. humicola, C. kefyr and C. krusei were the lowest sensitive to tested oil. The MICs of oil were in ranges from 37,5 to = 50,0 mg/ml.
Key words: susceptibility, yeastlike fungi, infection, oral cavity, respiratory tract, cedar oil
Cedr atlaski (cedr atlantycki) był ceniony i używany do celów budulcowych już w Starożytności. Olejek cedrowy wykorzystywali zarówno starożytni Egipcjanie, jak i Grecy, do balsamowania zmarłych, ponieważ wierzyli, że takie postępowanie prowadzi do nieśmiertelności. Olejek służył też do wyrobu perfum i kosmetyków. Nazwa cedr pochodzi od arabskiego słowa „kedron” oznaczającego moc. W czasach Starożytnych cedr był uważany za drzewo niezniszczalne i był symbolem długowieczności. Obecnie używany jest w przemyśle kosmetycznym i służy do produkcji perfum, mydeł, kremów, detergentów, płynów do zmywania i środków przeciw insektom. Cedr atlantycki ( Cedrus atlantica Endl, Manetti) jest wiecznie zielonym drzewem. Rośnie w kształcie piramidy, osiągając wysokość do 35-40 m. Wydziela charakterystyczny silny, zapach pochodzący od olejku zgromadzonego w miazdze i korze drzewa. Olejek cedrowy uzyskuje się na drodze destylacji drewna z parą wodną. Produkowany jest głównie w Libanie i Maroku. Z badań przeprowadzonych przez Krauze-Baranowską (1) wynika, że olejek cedrowy zawiera 53 różne składniki, wśród których są obecne seskwiterpeny, w tym α-, β- i γ-himachaleny oraz kadinen, cedren, cedrenol, cedrol, pinen, borneol i terpinen. Olejek eteryczny z cedru ma szereg właściwości leczniczych (1-6). Stosowany jest w zakażeniach górnych i dolnych dróg oddechowych, ze względu na działanie antyseptyczne i rozkurczające drogi oddechowe oraz wzmagające wydzielanie śluzu. Wykazuje aktywność moczopędną, żółciopędną, pobudza wydzielanie soków trawiennych i wzmaga apetyt. Działa pobudzająco na układ krążenia. Stosowany jest w leczeniu niektórych chorób skóry, w tym trądziku, przyspiesza gojenie w owrzodzeniach, oparzeniach, egzemach oraz zmianach skórnych w przebiegu brucelozy. Jest wykorzystywany jako środek przeciwłupieżowy, przeciwłojotokowy i wzmaga porost włosów. Stosowany zewnętrznie działa rozgrzewająco i przeciwbólowo w reumatyzmie, bólach mięśniowo-stawowych i nerwobólach. Wykazano też, że pasta do zębów, pod nazwą Kedra, zawierająca olejek cedrowy (z cedru syberyjskiego), działa skutecznie w chorobach przyzębia i w zapaleniu dziąseł. Olejek cedrowy nie powinien być stosowany u kobiet w ciąży. Ponadto wykazano, że olejek skutecznie odstrasza insekty, w tym także moskity przenoszące zarodźca malarii, w związku z tym jest używany jako repelent (7).
Wyniki doświadczeń wskazują na aktywność przeciwdrobnoustrojową olejku cedrowego (1, 4, 8-21). Hammer i wsp. (18) w badaniach in vitro wykazali dużą aktywność olejku wobec szczepów Enterococcus faecalis (MIC = 5 mg/ml) i znacznie niższą na szczepy z gatunku Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Psedomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Aeromonas sobria, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium i Candaida albicans (MIC>20 mg/ml). Maruzzella i wsp. (12) oceniali działanie olejku na wiele drobnoustrojów, jednak wykazali aktywność tylko wobec szczepów z gatunku Mycobacterium avium i Bacillus subtilis. Natomiast olejek był nieskuteczny wobec szczepów Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis i Salmonella typhi.
W kolejnych badaniach Chao i wsp. (9) wykazali znaczną skuteczność działania olejku z drzewa cedrowego na szczepy metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus (MRSA). W doświadczeniach Kędzi i wsp. (11) szczepy Gram-dodatnich bakterii z gatunku Staphylococcus aureus i Enterococcus faecalis były wrażliwe na niskie stężenia olejku, wynoszące 75 ?g/ml, a Gram-ujemne pałeczki, tj. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i Pseudomonas aeruginosa, na wyższe stężenia; w zakresie 500-750 ?g/ml. W innych badaniach (10) użyto olejek w rozcieńczeniach od 1:1 do 1:20 i stwierdzono, że w przypadku szczepów z gatunku Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus subtilis stężenie hamujące wzrost wynosiło 1:10, a szczepy z gatunku Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli nie były wrażliwe w zakresie ocenianych rozcieńczeń.
Morris i wsp. (13) wykazali, że olejek z cedru atlantyckiego był aktywny wobec szczepów ziarniaków z gatunku Staphylococcus aureus (500 ?g/ml), a pozostałe szczepy, w tym Escherichia coli, Corynebacterium sp. i Candida albicans wymagały użycia wyższych stężeń (≥1000 ?g/ml). W innych doświadczeniach wykazano, że zarówno formy wegetatywne laseczek, jak i ich formy przetrwalnikowe, wykazują wrażliwość na olejek. Rozwój przetrwalników Bacillus cereus i Clostridium botulinum był hamowany w stężeniu wynoszącym odpowiednio 100 i 300 ?g/ml (19). Badania potwierdziły też aktywność olejku wobec różnych bakterii beztlenowych wyizolowanych z zakażeń dróg oddechowych i jamy ustnej (MIC w zakresie stężeń ≤ 0,06 – ≥ 3,0 mg/ml).
Szereg doświadczeń wskazuje na przeciwgrzybiczną aktywność olejku cedrowego (11, 12, 14, 16, 17). Maruzzella i wsp. (16) oceniali działanie wyciągów z drewna i igieł cedrowych wobec grzybów drożdżopodobnych oraz pleśniowych i stwierdzili aktywność przeciwgrzybiczną tylko wyciągu z igieł. Autorzy wykazali wrażliwość grzybów drożdżopodobnych z gatunku Candida albicans, C. krusei, C. tropicalis, Cryptococcus neoformans i Saccharomyces cerevisiae oraz grzybów pleśniowych z gatunku Aspergillus fumigatus, A. niger, Alternaria solani, Penicillium digitatum, Rhizopus nigricans i Mucor mucedo. Z badań przeprowadzonych przez Yosefa i wsp. (15) wynika, że szczepy z gatunku Candida albicans, Aspergillus niger, Penicillium chrysogeum, z rodzaju Mucor i Rhizopus, były wrażliwe na stężenia <50 mg/ml. W kolejnych doświadczeniach wykazano wrażliwość grzybów drożdżopodobnych oraz dermatofitów w zakresie stężeń od 100 do 750 ?g/ml (11). Podobne wartości MIC dla dermatofitów (>100 ?g/ml) uzyskali inni autorzy (14). Natomiast testowane przez Scora i wsp. (17) grzyby pleśniowe z gatunku Penicillium digitatum, P. italicum i P. ulaiense okazały się wrażliwe na składniki olejku cedrowego, w tym na α-cedren (z wyjątkiem P. digittlum), D-2-karen i D-3-karen, przy czym ten ostatni był najskuteczniejszy w działaniu. Opisane powyżej doświadczenia dotyczyły działania olejku cedrowego wobec niektórych gatunków grzybów drożdżopodobnych i nie obejmowały większości gatunków, które często uczestniczą w zakażeniach w obrębie jamy ustnej i dróg oddechowych.
Celem badań było oznaczenie wrażliwości na olejek cedrowy grzybów drożdżopodobnych wyizolowanych z zakażeń jamy ustnej i dróg oddechowych.
Materiały i metody
Materiały zostały pobrane od pacjentów z objawami kandydozy w obrębie jamy ustnej (38 wymazów) lub dróg oddechowych (14 wymazów). Wymazy posiewano na podłoże Sabourauda i inkubowano w temp. 37°C przez 24-48 godz. Grzyby drożdżopodobne identyfikowano na podstawie morfologii komórek w preparacie barwionym metodą Grama, wyglądu kolonii i wzrostu na podłożu CHROMagar Candida (BioRad), cech biochemicznych (20 C AUX, Bio Merieux), zdolności do filamentacji i tworzenia chlamydospor.
Do badań wykorzystano 63 szczepy z gatunków: Candida albicans (24 szczepy), C. glabrata (7), C. guilliermondi (1), C. humicola (1), C. kefyr (4), C. krusei (6), C. lusitaniae (3), C. parapsilosis (6), C. tropicalis (9), C. utilis (2) oraz 6 szczepów wzorcowych z gatunków: C. albicans ATCC 90028, C. glabrata ATCC 66032, C. guilliermondii ATCC 6260, C. krusei ATCC 14243, C. parapsilosis ATCC 22019 i C. kefyr ATCC 4130. Badanie wrażliwości (MIC) na olejek cedrowy (Avicenna-Oil, Wrocław) przeprowadzono metodą seryjnych rozcieńczeń w agarze Sabourauda. Najpierw 100 mg olejku rozpuszczono w DMSO (Serva). Dalsze rozcieńczenia były przygotowywane w jałowej wodzie destylowanej, w celu uzyskania stężeń wynoszących 3,1, 6,2, 12,5, 25,0, 37,5 i 50,0 mg/ml. Inokulum zawierające 106 CFU na kroplę nanoszono na powierzchnię podłoża aparatem Steersa. Podłoże nie zawierające olejku stanowiło kontrolę wzrostu szczepów. Hodowlę posiewów i podłoży kontrolnych prowadzono w warunkach tlenowych przez 24 godz. w temp. 37°C. Za MIC uznano takie najniższe stężenie olejku, które całkowicie hamowało wzrost ocenianych szczepów grzybów drożdżopodobnych.
Wyniki i dyskusja
W tabeli 1 zostały zebrane wyniki badań wrażliwości na olejek cedrowy grzybów drożdżopodobnych wyizolowanych od pacjentów, a w tabeli 2 szczepy wzorcowe grzybów. Spośród 63 testowanych szczepów grzybów największą wrażliwość wykazały gatunki Candida parapsilosis i C. utilis. Wartości stężeń hamujących wzrost wynosiły ≤3,1-25,0 mg/ml. Niższą wrażliwość wykazały kolejne gatunki, tj. C. glabrata, z których 43% wykazało wrażliwość na 6,2 mg/ml. Natomiast na stężenie wynoszące 25,0 mg/ml wrażliwość wykazały 44% szczepów z gatunku C. lusitanie i 22% szczepów z gatunku C. tropicalis. Z najliczniej reprezentowanego gatunku C. albicans tylko 8% szczepów okazało się wrażliwych na stężenie wynoszące 25,0 mg/ml. W zakresie stężeń od 37,5 do 50,0 mg/ml wrażliwych było 75% szczepów. Natomiast 17% szczepów nie wykazywało wrażliwości w zakresie ocenianych stężeń.
Tabela 1. Wrażliwość na olejek cedrowy grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida.
| Grzyby drożdżopodobne | Liczba szczepów | Najniższe stężenie hamujące
MIC mg/ml |
| ł 50,0 | 37,5 | 25,0 | 12,5 | 6,2 | Ł 3,1 |
| Candida albicans | 24 | 14 | 8 | 2 | | | |
| Candida glabrata | 7 | 2 | 2 | | | 3 | |
| Candida guillirmondii | 1 | | 1 | | | | |
| Candida humicola | 1 | | 1 | | | | |
| Candida kefir | 4 | 3 | 1 | | | | |
| Candida krusei | 6 | 5 | 1 | | | | |
| Candida lusitaniae | 3 | | 2 | 1 | | | |
| Candida parapsilosis | 6 | | | 5 | | | 1 |
| Candida tropicalis | 9 | 5 | 2 | 1 | | | 1 |
| Candida utilis | 2 | | | 1 | | | 1 |
| Candida spp. ogółem | 63 | 29 | 18 | 10 | | 3 | 3 |
Tabela 2. Wrażliwość na olejek cedrowy szczepów wzorcowych grzybów z rodzaju Candida.
| Grzyby drożdżopodobne | Liczba szczepów | Najniższe stężenie hamujące
MIC mg/ml |
| ł 50,0 | 37,5 | 25,0 | 12,5 | 6,2 | Ł 3,1 |
| Candida albicans ATCC 90028 | 1 | 1 | | | | | |
| Candida glabrata ATCC 66032 | 1 | | 1 | | | | |
| Candida parapsilosis ATCC 22019 | 1 | | | | 1 | | |
| Candida guilliermondii ATCC 6260 | 1 | | 1 | | | | |
| Candida kefyr ATCC 4130 | 1 | | 1 | | | | |
| Candida krusei ATCC 14243 | 1 | 1 | | | | | |
Morris i wsp. (13) także wykazali, że szczep C. albicans był wrażliwy na stężenie>1000 ?g/ml. Zbliżone wartości MIC, do uzyskanych w tych badaniach, wykazali dla szczepu C. albicans Yousef i wsp. (15) (MIC <20 mg/ml). Również w badaniach Hammera i wsp. (18) wartości MICs wynosiły>20 mg/ml. Natomiast szczepy grzybów testowanych przez Kędzię i wsp. (11) charakteryzowały się wysoką wrażliwością. Wzrost szczepów z gatunku C. albicans, C. krusei i Geotrichum candidum był hamowany przez stężenia wynoszące 750 ?g/ml. Szczepy pozostałych gatunków grzybów ocenianych w moich badaniach, w tym C. guilliermondii, C. humicola, C. kefyr i C. krusei okazały się mniej wrażliwe. Wartości MIC mieściły się w zakresie 37,5- ≥50,0 mg/ml.
Podsumowując wyniki należy podkreślić, że olejek cedrowy w niższych stężeniach (MIC w zakresie 3,1-25 mg/ml) był aktywny wobec 25% szczepów. Jednak 14% spośród wszystkich objętych doświadczeniem szczepów grzybów drożdżopodobnych wymagało do zahamowania wzrostu stężeń wynoszących ponad 50 mg/ml.
Wnioski
1. Spośród wszystkich ocenianych grzybów drożdżopodobnych największą wrażliwość na olejek cedrowy wykazały szczepy z gatunku Candida parapsilosis i C. utilis
2. Olejek był mniej aktywny wobec gatunków C. guilliermondii, C. humicola, C. kefyr i C. krusei.
Piśmiennictwo
1. Krauze-Baranowska M, Skwierawska J, Pobłocka L. Właściwości lecznicze cedrów – historia i współczesność. Post Fitoter 2003; 1:2-5 2. Edris AE. Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituents: A review. Phytother Res 2007; 21:308-23. 3. Alexander M. Aromatherapy and immunity: How the use of essential oils. AIDS immune potentiality. Part IV. Modulating immunity with aromatherapy: Conditioning, suppression and stimulation of the immune system. Int J Aromather 2002; 12(1):49-56. 4. Digrak M, Ileim A, Alma MH. Antimicrobial activities of several parts of Pinus brutia, Juniperus oxycedrus, Abies ciliate, Cedrus libanii and Pinus nigra.Phytother Res 1999; 13:584-7. 5. Walters C. Aromatherapy – An Ilustrated Guide. Element Books LTD, Dorset 1998. 6. Clevland DEH. Acne vulgaris. Cand Med Assoc J 1928; 18(3):261-6. 7. Trongtokit Y, Rongriyam Y, Komalamisra N i wsp. Comparative repellency of 38 essential oils against mosquito bites. Phytother Res 2005; 19:303-9. 8. Góra J. Przeciwbakteryjne działanie olejków eterycznych. Aromaterapia 1996; 4/6:2-4. 9. Chao S, Young G, Oberg C i wsp. Inhibition of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by essential oils. Flav Fragr J 2008; 23:444-9. 10. Prabuseenivasan S, Jayakumar M, Ignacimuthu S. In vitro antibacterial activity of some plant essential oils. BCM Complement Altern Med 2006; 6(39):1-8. 11. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Badanie wpływu olejków eterycznych na bakterie, grzyby i dermatofity chorobotwórcze dla człowieka. Post Fitoter 2007; 2:71-7. 12. Maruzzella J, Sicurella NA. Antibacterial activity of essential oils vapors. J Am Pharm Assoc 1960; 49:692-4. 13. Morris JA, Khettry A, Seitz EW. Antimicrobial activity of aroma chemicals and essential oils. J Am Oil Chem Soc 1979; 56:595-603. 14. Inouye S, Uchida K, Abe S. Vapor activity of 72 essential oils against a Trichophyton mentagrophytes. J Infect Chem 2006; 12:210-6. 15. Yosef RT, Tawil G. Antimicrobial activity of volatile oils. Pharmazie 1980; 35H(11):698-701. 16. Maruzzella JC, Liguori L. The in vitro antifungal activity of essential oils. J Am Pharm Assoc 1956; 47(4):250-4. 17. Scora K, Scora RW. Effect of volatiles on mycelium growth of Penicillium digitatum, P. italicum and P. uliense. J Basic Microbiol 1998; 38(5-6):405-13. 18. Hammer KA, Carson CF, Kiley TV. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. J Appl Microbiol 1999; 86:985-90. 19. Chabi A, Ababouch LH, Belasri K i wsp. Inhibition of germination and vegetative growth of Bacillus cereus T and Clostridium botulinum 62A spores by essential oils. Food Mirobiol 1977; 14:161-74. 20. Pawar VC, Thaker VS. In vitro efficacy of 75 essential oils against Aspergillus niger. Mycoses 2006; 49:316-23. 21. Kędzia A. Działanie olejku cedrowego ( Oleum cedri) na bakterie beztlenowe. Post Fitoter 2009; 2:71-6.
otrzymano/received: 2010-03-02
zaakceptowano/accepted: 2010-03-18
Adres/address:
*Anna Kędzia
Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej
Katedra Mikrobiologii GUMed
ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk
tel. (58) 349-21-85
e-mail: zmju@amg.gda.pl
