Charakterystyczną aberracją cytogenetyczną dla przewlekłej białaczki szpikowej (PBS) jest chromosom Philadelphia (Ph⁺), który powstaje w wyniku wzajemnej translokacji długich ramion chromosomów pary 9 i 22 (9q+; 22q-). U około 3-5% chorych na PBS, u których nie stwierdza się chromosomu Ph⁺ w badaniu cytogenetycznym, wykrywany jest jego molekularny ekwiwalent, gen fuzyjny BCR-ABL. Celem leczenia PBS jest doprowadzenie do całkowitego wyleczenia lub osiągnięcie najdłuższego przeżycia co można osiągnąć poprzez eradykację klonu nowotworowego Ph⁺ (remisja cytogenetyczna) oraz wszystkich przetrwałych komórek zawierających transkrypt BCR-ABL (remisja molekularna). Szansą zredukowania liczby patologicznych komórek, aż do poziomu niewykrywalnego dostępnymi aktualnie metodami diagnostycznymi, jest przeszczepienie allogenicznych macierzystych komórek krwiotwórczych (alloHSCT) wykonane w fazie przewlekłej choroby, najlepiej w ciągu 12 miesięcy od rozpoznania (1, 2).

Ryzyko nawrotu białaczki wzrasta wraz ze stopniem zaawansowania choroby przed przeszczepieniem. Prawdopodobieństwo wznowy PBS w przypadku wykonania alloHSCT w fazie przewlekłej choroby od dawców spokrewnionych, wynosi 10-20% w ciągu 5 lat po transplantacji (3, 4, 5). W przypadku stwierdzenia obecności genu BCR - ABL w 6-12 miesięcy po alloHSCT, ryzyko nawrotu białaczki wzrasta nawet do 40% (6). Zdarza się jednak, że pacjenci wykazujący obecność genu BCR-ABL w 2-3 roku po przeszczepieniu przeżywają długie lata w remisji cytogenetycznej i hematologicznej.

Do wykrywania genu fuzyjnego BCR - ABL lub jego transkryptów można zastosować szereg różnorodnych metod (Southern blotting, Western blotting, FISH), jednak tylko metody molekularne (RT-PCR, RQ-PCR), ze względu na swoją wysoką czułość i swoistość, są w stanie dokładnie ocenić stan remisji PBS. Wczesne wykrycie genu BCR-ABL, zwłaszcza po jego uprzedniej nieobecności, umożliwia podjęcie możliwie szybko odpowiednich działań terapeutycznych. Polegają one najczęściej na przerwaniu leczenia immunosupresyjnego i/lub zastosowaniu infuzji limfocytów dawcy (DLI), co na drodze immunologicznej reakcji przeszczep przeciw białaczce (GvL) może prowadzić do uzyskania ponownej remisji choroby.

Stopień zmniejszenia liczby komórek białaczkowych Ph⁺ w trakcie leczenia cytoredukcyjnego i/lub po alloHSCT jest ważnym czynnikiem prognostycznym dla chorych na PBS. Najczęstszą przyczyną progresji/nawrotu choroby jest obecność komórek białaczkowych (MRD), które nie zostały wyeliminowane w toku tego postępowania. Ponadto wiadomo, że chorzy z obecnością choroby resztkowej mogą różnić się między sobą liczbą przetrwałych komórek (białaczkowych) (7). Uzasadnia to potrzebę zastosowania ilościowej metody oceny MRD i badania zależności pomiędzy jej nasileniem, a przebiegiem choroby. Monitorowanie chorych poddanych alloHSCT jest niezwykle istotne z punktu widzenia oceny skuteczności zastosowanego leczenia oraz stratyfikacji do grupy podwyższonego, średniego lub niskiego ryzyka wystąpienia nawrotu białaczki (8, 9, 10). Brak lub utrzymujący się długotrwale niski poziom mRNA dla BCR-ABL oznaczają niewielkie ryzyko wznowy PBS (9%), w porównaniu do 74% ryzyka nawrotu w grupie chorych z narastającym lub stale wysokim poziomem BCR-ABL (8). Gen BCR - ABL może być obecny u 25-50% chorych nawet powyżej 3-go roku po alloHSCT, przy jednoczesnym ryzyku wznowy w tej grupie chorych wynoszącym 10-20% (6). Wskazuje to, że wykrycie samej obecności BCR-ABL nie przesądza, że jest on złym czynnikiem prognostycznym, natomiast rzeczywista predykcyjna wartość wykrywania MRD jest ściśle związana z ilościową oceną transkryptu BCR - ABL (4, 8, 9, 10, 11).

W tym celu najlepszą metodą monitorowania choroby resztkowej jest RQ-PCR, który umożliwia bezpośredni pomiar ilości produktu PCR podczas procesu amplifikacji i pozwala na faktyczne odzwierciedlenie dynamiki reakcji. Końcowa ilość produktu, który uzyskuje się w fazie plateau w metodzie RT-PCR zazwyczaj nie koreluje z ilością początkową matrycy, natomiast cykl, w którym fluorescencja dla konkretnej próbki wzrasta do poziomu wykrywalnego, umożliwia ocenę liczby kopii w przeliczeniu na określoną ilość mRNA.

Celem obecnych badań była ilościowa ocena transkryptu BCR-ABL za pomocą RQ-PCR u chorych na PBS po alloHSCT dla oszacowania ryzyka wystąpienia wznowy białaczki i podjęcia szybkich działań terapeutycznych ukierunkowanych na uzyskanie ponownej remisji choroby.

Pacjenci. Do badań zakwalifikowano 75 chorych z rozpoznaniem PBS BCR/ABL +, którzy zostali poddani alloHSCT w fazie przewlekłej choroby w latach 1995-2006. Chorzy byli rekrutowani do badania z kilku ośrodków hematologicznych w Polsce, w tym 40 chorych z Kliniki Hematologii i Transplantologii Akademii Medycznej w Gdańsku, 19 z Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, 6 chorych z Ośrodka Transplantacji Szpiku Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie, 5 chorych z Kliniki Hematologii Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie oraz 5 chorych z Oddziału Hematologii Szpitala Miejskiego w Toruniu. Bieżącej analizie poddano 66 chorych, u których wykonano, co najmniej 2 oznaczenia ilościowe genu BCR-ABL powyżej 6-go miesiąca po transplantacji. Mediana wieku przy rozpoznaniu PBS wynosiła 38 lat (zakres, 16-54), podobnie jak mediana wieku w czasie transplantacji (zakres, 16-55). Charakterystyka kliniczna badanej grupy chorych została przedstawiona w tabeli 1.

Leczenie. Przed wykonaniem alloHSCT, 18 chorych (27%) leczono imatinibem, w czterech przypadkach (6%) zastosowano leczenie interferonem alfa, trzech chorych (5%) z powodu zaostrzenia choroby leczono arabinozydem cytozyny (AraC), a u jednego chorego (2%) zastosowano połączenie cytostatyków (daunorubicyna – 3 dni + AraC – 7 dni) z powodu bazofilowej kryzy blastycznej. W pozostałych przypadkach (60%) stosowano leczenie cytoredukcyjne hydroksykarbamidem.

Postępowanie mieloablacyjne przed alloHSCT, (obejmujące zastosowanie busulfanu, cyklofosfamidu lub TBI – total body irradiation), stosowano u 49 z 66 chorych (74%). Kondycjonowanie zawierające fludarabinę, treosulfan i immunoglobulinę antytymocytarną otrzymało 15 chorych (23%). Dwóch chorych (3%) otrzymało niemieloablacyjne przygotowanie do transplantacji z powodu zaawansowanego wieku.

Wszyscy chorzy zostali poddani przeszczepieniu w fazie przewlekłej choroby, w tym 53 (80%) w pierwszej fazie przewlekłej i 13 (20%) w drugiej fazie przewlekłej. Dwóch chorych zakwalifikowano do powtórnej alloHSCT. U 54 chorych (82%) wykonano transplantację od zgodnego dawcy, a w 12 przypadkach (18%) od dawcy częściowo zgodnego. Komórki macierzyste z krwi obwodowej przeszczepiono 30 chorym (46%), 22 chorym (33%) przeszczepiono komórki macierzyste uzyskane ze szpiku, 5 chorym (8%) oba rodzaje komórek krwiotwórczych z krwi i szpiku, natomiast w 9 przypadkach brak było informacji dotyczących rodzaju przeszczepionych komórek krwiotwórczych. W profilaktyce choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) u 58 chorych (88%), stosowano cyklosporynę i metotreksat, a w 8 przypadkach zastosowano inne leczenie.

Mediana czasu od rozpoznania PBS do przeprowadzenia alloHSCT wynosiła 8 miesięcy (zakres, 2,5-59), natomiast mediana całkowitego czasu obserwacji dla badanej populacji chorych wyniosła 50 miesięcy (zakres 2-143). Wznowę molekularną PBS stwierdzono u 8 chorych (13%). Mediana czasu od przeprowadzenia alloHSCT do chwili rozpoznania wznowy choroby wyniosła 25,5 miesiąca (zakres 7-63). W obserwowanej grupie chorych stwierdzono 5 zgonów po transplantacji, w tym 4 z powodu GvHD (mediana 8 miesięcy, zakres 2-12) oraz jeden z powodu progresji PBS po 8 latach od alloHSCT.

Ocena transkryptu. Krew obwodową i/lub szpik kostny badano na obecność genu BCR-ABL w odstępach 1, 3, 6 lub 12-miesięcznych. Z uzyskanych w wyniku wirowania w gradiencie stężeń komórek jednojądrzastych metodą kolumienkową izolowano całkowite RNA, a następnie poddawano odwrotnej transkrypcji z użyciem SuperScript II i random heksamerów. Wszystkie próbki cDNA badano równocześnie metodą jakościową (RT/nested PCR) oraz ilościową (RQ-PCR). Parametry i startery reakcji PCR, nested PCR i real-time PCR zostały ustalone wg wytycznych badania BIOMED-1 (12) oraz Europe Against Cancer (EAC) (13).

Do reakcji RQ-PCR stosowano ekwiwalent 100 ng RNA w objętości końcowej reakcji 25 ?l. Każdemu badaniu towarzyszyły kontrole dodatnie (cDNA z linii K562 BCR - ABL + lub z próbki diagnostycznej chorego) oraz kontrole ujemne (NTC, NAC). Krzywa standardowa została sporządzona z wyników uzyskanych w badaniach linii komórkowej K562 w zakresie 2,91x10⁵ do 2,91x10¹ kopii BCR-ABL/10⁴ ABL. Badania przeprowadzane były w tripletach. W celu wystandaryzowania poziomu mRNA BCR-ABL, każdą badaną próbkę amplifikowano równocześnie na obecność genu kontrolnego ABL (13, 14). Do analizy zakwalifikowano te próbki, w których wartość Ct ( threshold cycle) dla genu kontrolnego ABL wynosiła poniżej 30 i w tych eksperymentach, w których zostały spełnione następujące warunki dla reakcji RQ-PCR ( slope -3,3 do -3,8; baseline 3-15; ΔRn>1; ΔCt≤ 1,0; threshold 0,1). Wyniki ekspresji genu BCR-ABL przedstawiono metodą pośrednią i wyrażono jako stosunek ilości kopii genu BCR-ABL do ABL w każdej próbce i odniesiono do średnich wartości współczynnika BCR-ABL wyliczonego wg EAC.

Kryteria choroby resztkowej i wznowy molekularnej. Na podstawie ilości transkryptu BCR-ABL stwierdzanego we krwi i/lub szpiku chorych po alloHSCT, wyodrębniono 3 kategorie MRD, w tym charakteryzującą się stale niskim poziomem transkryptu BCR-ABL (0,005-0,001% lub poniżej 0,001%), zmiennym, ale nie przekraczającym 0,01% poziomem BCR-ABL oraz wysokim poziomem transkryptu (w granicach 0,01-0,05%). Do stwierdzenia wznowy molekularnej PBS po alloHSCT stosowano kryteria wg Olavarria i wsp. (8) oraz Kaeda i wsp. (9). Pozwalają one stwierdzić nawrót molekularny białaczki w przypadkach, gdy w trzech kolejnych oznaczeniach wykonywanych w odstępach, co najmniej 30-dniowych współczynnik BCR-ABL/ABL wynosi powyżej 0,02% lub w dwóch kolejnych oznaczeniach BCR-ABL/ABL wynosi powyżej 0,05% lub, gdy stwierdza się narastającą ilość transkryptu BCR-ABL w 3 kolejnych badaniach, przy czym w 2 oznaczeniach przekraczają one wartość 0,02%. U chorych wykonano od 2-15 badań ekspresji genu (mediana 5 badań). W przypadku stwierdzenia wzrostu ilości transkryptu BCR-ABL, badania wykonywano, co miesiąc.

Zastosowanie metody jakościowej (RT/nested PCR) w badanej grupie 66 chorych, pozwoliło na stwierdzenie transkryptu b3a2 BCR-ABL u 34 chorych (52%) i b2a2 u 27 chorych (41%). U 5 chorych nie udało się określić typu transkryptu BCR-ABL. Stosując podane wyżej kryteria choroby resztkowej, MRD ze stale niskim poziomem transkryptu BCR-ABL stwierdzono po alloHSCT u 35 chorych (53%), 11 chorych (17%) charakteryzowało się zmiennym, ale nie przekraczającym 0,01% poziomem BCR-ABL i 18 chorych (27%) miało wysoki poziom transkryptu (>0,01%). Dwóch chorych nie zakwalifikowano do żadnej z podgrup, ze względu na fakt, że podczas monitorowania MRD nie uzyskano remisji molekularnej.

W badanej grupie 66 chorych wznowę molekularną PBS stwierdzono w 8 przypadkach (13%). Wśród 35 chorych z niskim poziomem MRD, wznowę molekularną stwierdzono w 2 przypadkach (6%), w grupie 11 chorych ze zmiennym poziomem BCR-ABL w 1 przypadku (9%), natomiast w grupie 18 chorych z wysokim poziomem MRD, wznowę molekularną stwierdzono u 5 chorych (28%). Wyższy poziom choroby resztkowej pozostawał w korelacji z większym ryzykiem wystąpienia wznowy molekularnej PBS (nieparametryczny współczynnik korelacji rang Spearmana (p=0,02) (tab. 2).

Ponadto stwierdzono tendencję do krótszego czasu wystąpienia wznowy molekularnej u chorych z wysokim poziomem ilości transkryptu BCR-ABL (89 miesięcy) w porównaniu do chorych ze zmiennymi ilościami transkryptu (106 miesięcy) oraz grupą chorych z niskim lub niewykrywalnym metodą RQ-PCR poziomem BCR-ABL (134 miesiące) (tab. 3, ryc. 1). Średni czas przeżycia chorych w grupie z niskim poziomem MRD był dłuższy (131 miesięcy) w porównaniu do chorych ze zmiennym (107 miesięcy) lub wysokim poziomem (111 miesięcy) transkryptu BCR-ABL (tab. 4, ryc. 2).

Transkrypt BCR-ABL, charakterystyczny dla PBS może być wykrywany w krwi lub szpiku kostnym chorych na PBS przez kilka miesięcy po alloHSCT, a jego poziom może mieć znaczenie predykcyjne dla wystąpienia wznowy choroby (15, 16, 17, 18, 19). Stwierdzenie obecności genu BCR-ABL zależy również od czasu jego detekcji po transplantacji. Wykrywany 6-12 miesięcy po przeszczepieniu oznacza zwiększone ryzyko wznowy o około 40%, natomiast samo stwierdzenie obecności BCR-ABL powyżej 36 miesiąca po alloHSCT (25-50% chorych) jest związane z ok. 10% ryzykiem wznowy białaczki (6). Chorzy, u których nie stwierdza się obecności BCR-ABL w okresie 3-5 miesiąca po alloHSCT mają niskie prawdopodobieństwo wznowy choroby w ciągu 3 lat, wynoszące około 17%, podczas gdy u chorych z niskim lub względnie wysokim poziomem ryzyko wznowy wynosi odpowiednio 42,9% oraz 86% (8). Obecność tzw. późnej MRD, powyżej 18 miesiąca po transplantacji, ma również znaczenie prognostyczne (30% ryzyko wznowy), natomiast brak choroby resztkowej jest związany z niskim, 3% ryzykiem wznowy molekularnej PBS (9). Nasze wyniki badań potwierdzają istnienie korelacji pomiędzy poziomem transkryptu BCR-ABL,a ryzykiem wznowy PBS, który wyniósł dla chorych z wysokim i zmiennym poziomem MRD odpowiednio 28% i 9%, a dla grupy chorych z niskim lub nie wykrywalnym poziomem BCR-ABL – 6%. Stwierdzono również zależność pomiędzy poziomem MRD, a czasem wolnym od nawrotu choroby, jednak prawdopodobnie ze względu na małą liczebność analizowanych grup chorych, nie wykazano istotności statystycznej w tym zakresie.

Monitorowanie kinetyki poziomu BCR-ABL,często nawet na kilka miesięcy przed wykryciem chromosomu Ph⁺ metodami cytogenetycznymi, umożliwia rozpoznanie wznowy PBS po alloHSCT. Dla takich pacjentów standardowym leczeniem jest zredukowanie dawek leków immunosupresyjnych i/lub zastosowanie DLI w celu wywołania immunologicznej reakcji przeszczep przeciw białaczce (GvL). Skuteczność takiej formy leczenia jest większa w okresie wznowy molekularnej niż cytogenetycznej lub hematologicznej, a także w fazie przewlekłej choroby w porównaniu do akceleracji lub kryzy blastycznej. Odsetek korzystnych odpowiedzi na DLI w PBS wynosi 60-90% dla fazy przewlekłej, podczas gdy w fazie akceleracji odsetek ten wynosi około 30% (20, 21, 22, 23). W badanej grupie chorych, u dwóch pacjentów zaobserwowano 15-80-krotny wzrost ekspresji genu BCR-ABL w ciągu pierwszych 6 miesięcy po alloHSCT, bez innych objawów progresji choroby. W obu przypadkach redukcja dawek leków immunosupresyjnych wyzwalająca reakcję GvL, umożliwiła ponowne uzyskanie remisji molekularnej i spadek ilości transkryptu do wartości 0,001%. U jednego chorego, po alloHSCT stwierdzono graniczny poziom remisji molekularnej ( BCR-ABL/ABL = 0,1%), a po 7 miesiącach wznowę molekularną PBS. U pacjenta zastosowano bez powodzenia DLI, a następnie imatinib, doprowadzając do remisji molekularnej. U kolejnego chorego nie uzyskano remisji molekularnej w wyniku alloHSCT i 4 miesiące od transplantacji doszło do rozwoju przełomu blastycznego PBS. W leczeniu zastosowano leki wg programu FLAM (fludarabina, arabinozyd cytozyny, mitoksantron) oraz imatinib, w wyniku, którego to postępowania uzyskano drugą fazę przewlekłą choroby i dużą odpowiedź cytogenetyczną. Dane te potwierdzają praktyczne znaczenie monitorowania MRD za pomocą metod ilościowych u chorych na PBS, zwłaszcza po alloHSCT. Technika ta pozwala na ujawnienie progresji białaczki w okresie początkowym i jej leczenie w fazie ograniczonego zaawansowania klinicznego choroby i dużej wrażliwości na leczenie cytoredukcyjne (8-10, 17, 24-26).

Techniki jakościowe RT-PCR pozwalają na wykrywanie i precyzyjne rozpoznanie molekularne PBS, w tym zwłaszcza określenie typu transkryptu BCR-ABL, jednak nie umożliwiają monitorowania kinetyki jego poziomów. Do ich oceny metodą z wyboru pozostaje ilościowy RQ-PCR, który umożliwia monitorowanie nasilenia MRD, wczesne wykrycie wznowy molekularnej PBS i podjęcie odpowiednich działań terapeutycznych zapobiegających pełnoobjawowej progresji białaczki. Poziom uzyskanej remisji molekularnej ma zasadnicze znaczenie dla określenia ryzyka wznowy PBS po alloHSCT.