Główną fizjologiczną funkcją tarczycy jest produkcja hormonów T3 i T4. Pierwszym etapem biosyntezy hormonów tarczycy jest transport jonów jodkowych (I^-) z krwioobiegu do koloidu. Transport I^- w tarczycy przebiega w dwóch etapach i jest katalizowany przez NIS i pendrynę, białka zlokalizowane na przeciwnych biegunach tyreocyta. Symporter sodowo-jodowy (NIS) zlokalizowany jest w błonie podstawnej tyreocyta. Jego fizjologiczna rola polega na katalizowaniu aktywnego, sodowo-zależnego transportu jodków z krwi do wnętrza komórki tarczycy. Gen kodujący NIS znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 19 w pozycji 13 (19p13) i składa się z 15 egzonów oraz 14 intronów (1). Koduje białko zbudowane z 643 aminokwasów o masie molekularnej wynoszącej około 70-95 kDa. W strukturze przestrzennej tego białka występuje 13 trans-membranowych fragmentów. NIS należy do rodziny białek transportujących aniony SLC5A (ang. solute carrier family 5). Białka z tej rodziny wykazują wysoką homologię pomiędzy sobą i charakteryzują się zbliżoną funkcją. Wykorzystują elektrochemiczny gradient sodu, jako siłę napędową do transportu swoistej dla nich substancji (2, 3). Nagromadzone wewnątrz komórki jony I^- są następnie transportowane przez błonę szczytową do światła koloidu. Uważa się, że jednym z białek odpowiedzialnych za ten transport jest pendryna. Pendryna należy do rodziny białek transportujących aniony zwanej SLC26 (ang. solute carrier family 26). Białka z tej rodziny charakteryzuje duża jednorodność struktury przestrzennej. Ich podstawową funkcją jest transport jonów organicznych i nieorganicznych, a proces ten jest niezależny od gradientu jonów sodowych (4). Pendryna jest silnie hydrofobową błonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej ok. 115 kDa składającą się z 780 reszt aminokwasowych. Podobnie jak inne białka należące do rodziny transporterów SLC26 składa się z 12 dużych fragmentów przezbłonowych połączonych krótkimi pętlami ułożonymi naprzemiennie wewnątrz i zewnątrz cytoplazmatycznie. Fragmenty N- i C- końcowe białka zlokalizowane są wewnątrz komórki (5). Gen kodujący pendrynę oznaczony skrótem PDS (SLC26A4 ang. Pendred syndrome gene) sklonowano w 1997 roku (6). U ludzi gen PDS zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 7 w pozycji 31, w pobliżu genu DRA// CLT (SLC26A3) (7). Mutacje w obrębie genu PDS są odpowiedzialne za występowanie zespołu Pendreda, schorzenia charakteryzującego się wrodzoną głuchotą, częściowym defektem organifikacji jodków oraz wolem (8, 9).

Podczas transformacji nowotworowej w komórkach tarczycy obserwuje się nieprawidłowości w wewnątrzkomórkowym metabolizmie jonów jodkowych (10, 11). Wiążą się one ze zmianami lub brakiem ekspresji kluczowych białek zaangażowanych w proces biosyntezy hormonów takich, jak: TPO, Tg, NIS oraz pendryny (12,13).

W prezentowanej pracy badano poziom ekspresji NIS i pendryny w dużej grupie próbek pochodzących od pacjentów ze zróżnicowanymi rakami tarczycy w odniesieniu do tkanek prawidłowych pochodzących od tych samych pacjentów.

Tkanki tarczycy otrzymano z Centrum Onkologii Instytutu im. Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach. Do analizy metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (real-time) użyto 74 tkanek tarczycy pochodzących od 43 pacjentów (32 kobiet i 11 mężczyzn w wieku od 15 do 74 lat, średnia wieku 46 lat). Analizie poddano 31 tkanek prawidłowych i 43 zróżnicowane raki tarczycy z których ponad połowa (56%) była o średnicy>1 cm do ≤ 4 cm -T2. Wszystkie otrzymane pooperacyjnie skrawki tarczyc przechowywano w temperaturze -80°C.

Poziom ekspresji genu PDS w tkankach tarczycy analizowano metodą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym (real-time RT-PCR).

Do izolacji RNA wykorzystywano zestaw RNeasy Mini Kit (Qiagen). Całkowite RNA izolowano z około 100 mg tkanki zgodnie z załączoną przez producenta instrukcją.

Pomiarów stężenia otrzymanego RNA dokonywano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 260 nm w odniesieniu do długości fali 280 nm. Stosunek pomiaru stężenia przy długości fal: A₂₆₀/A₂₈₀ określał czystość preparatu i w większości badanych prób wynosił od 1.7-2.0. Próby, w których wartość współczynnika nie mieściła się w wymienionym zakresie odrzucano, a RNA ponownie izolowano.

Do syntezy cDNA wykorzystywano zestaw Superscript II RT (GIBCO-BRL). W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: heksamery o przypadkowej sekwencji (1μg), całościowe RNA (1μg), mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dATP, dTTP, DTP, dGTP) o stężeniu końcowym 200μM, inhibitor RNazy (1μl), 1x stężony bufor dla polimerazy oraz 200 jednostek odwrotnej transkryptazy (Invitrogen).

Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono w objętości 20 μl w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie przez 10 minut w temperaturze 70°C. Otrzymane cDNA przechowywano w -20°C.

Ilościowe oznaczenie poziomu mRNA dla NIS i pendryny oraz genu referencyjnego β-aktyny wykonano przy użyciu zestawu firmy PE Applied Biosystems.

Reakcję QRT-PCR prowadzono w aparacie GeneAmp 5700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) na 96 dołkowych płytkach w objętości 25 μl. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: gotowy zestaw starterów i sond dla genów NIS i PDS oraz referencyjnego genu β-aktyny (TaqMan Assays-on-demand gene expression, PE Applied Biosystems, PDS - Id: Hs00166504_ml i β-aktyna - Id: Hs99999903_ml), 1μg cDNA, TaqMan Universal PCR Master Mix 25 μl. Po wstępnej 10 minutowej denaturacji w temperaturze 95°C reakcję amplifikacji przeprowadzono w następujących warunkach:

l 30 cykli składających się z następujących etapów:

– denaturacja (w temp. 95°C przez 15 sek.),

– przyłączanie starterów i wydłużanie (w temp. 60°C przez 1 min.).

l 1 cykl składający się z końcowego wydłużania w temperaturze 72°C przez 10 minut.

Otrzymane wyniki ekspresji genu NIS i PDS normalizowano względem genu referencyjnego β-aktyny. W tym celu poziom ekspresji genu PDS określano z krzywej standardowej i dzielono przez poziom ekspresji genu β-aktyny. Do skonstruowania krzywej standardowej dla obu genów użyto cDNA z puli sześciu tkanek prawidłowych tarczycy w czterech różnych rozcieńczeniach cDNA: 200 ng, 50 ng, 12,5 ng, 3,125 ng. Dla każdej badanej próby wykonywano dwa powtórzenia, które uśredniano.

Wyniki analizowano używając aplikacji Q-Gene do Microsoft Excel(r).

Poziom ekspresji białka i jego lokalizację komórkową badano metodą immunohistochemiczną. Materiał stanowiły zaparafinowane archiwalne bloczki tkanek tarczycy. Reakcję immunochistochemiczą z przeciwciałami antyNIS i antypendryna przeprowadzono zgodnie z uprzednio opisaną procedurą (14, 16).

W opracowaniu statystycznym wyników stosowano test Whitneya-Manna, nieparametryczną korelację Spearmana. Istotność różnic na poziomie 5% (P ≤ 0,05) uznana była za istotną, a na poziomie 0,1% (P ≤ 0,001) za wysoce istotną.

Poziom ekspresji genu NIS i PDS w tkankach tarczycy badano metodą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym.

We wszystkich 31 analizowanych tarczycach prawidłowych oraz 43 zróżnicowanych rakach tarczycy wykryto transkrypt genów NIS i PDS. Obserwowany poziom ekspresji obu genów był heterogenny zarówno w analizowanych tkankach prawidłowych jak i w zróżnicowanych rakach tarczycy (ryc. 1). W części raków poziom mRNA NIS (14/33%) i PDS (2/5%) był bardzo niski (na granicy czułości metody).

W zróżnicowanych rakach tarczycy w zależności od wartości względnego poziomu ekspresji genu NIS wyróżniono trzy grupy tkanek. Do pierwszej grupy zaliczono 22 (51%) przypadki o poziomie ekspresji obserwowanej dla tkanek prawidłowych. Drugą grupę stanowiło 7 (16%) raków o obniżonej ekspresji w porównaniu do tkanek prawidłowych i ostatnią, trzecią grupę 14 (33%) tkanek o bardzo niskiej ekspresji genu NIS (tab.1). Zakres średniej znormalizowanej ekspresji (MNE) mRNA NIS w tarczycach prawidłowych wynosił od 0,02 do 3,8 a w rakach w od 0,0003 do 0,661 MNE. Średni poziom mRNA pendryny był wyższy w tkankach prawidłowych (3-krotnie) i w rakach (4-krotnie) od średniego poziomu mRNA dla NIS i wynosił w tarczycach prawidłowych od 0,08 do 8,06 a w rakach od 0,02 do 1,73.

Podobnie jak w przypadku genu NIS analiza poziomu mRNA PDS w rakach tarczycy pozwoliła na wyróżnienie trzech grup tkanek (tab. 2). Do pierwszej grupy zaliczono większość przypadków 30 (70 %) w drugiej grupie znalazło się 11 (25 %) raków, a tylko 2 (5 %) stanowiły trzecią grupę raków o bardzo niskiej ekspresji genu PDS (tab. 2).

Jakkolwiek obserwowano zróżnicowaną ekspresję genów NIS i PDS to jej średni poziom w analizowanych rakach był znamiennie statystycznie ( P <0,001) obniżony w porównaniu do tkanek prawidłowych pochodzących od tych samych pacjentów (ryc. 2). Średnio mRNA NIS był 8-krotnie, a genu PDS 6-krotnie obniżony w porównaniu do poziomu w tarczycach prawidłowych.

Poziom ekspresji genów NIS i PDS nie korelował ze stopniem zaawanso-wania klinicznego ani z wielkością gu-za. Nie stwierdzono również istotnej statystycznie korelacji pomiędzy poziomem ekspresji genu NIS a poziomem ekspresji genu PDS w tkankach prawidło-wych i rakach tarczycy (ryc. 2). W tkankach, których utraciły ekspresję NIS obserwowano ekspresję pendryny, a w tkankach negatywnych dla pendryny obserwowano ekspresję NIS.

Stosując wysoko oczyszczone przeciwciała antyNIS oraz antypendryna w tarczycach prawidłowych obserwowano intensywną i heterogenną reakcję obu białek. NIS zlokalizowany był w błonie podstawnej a pendryna w błonie szczytowej tyreocytów (ryc. 3A, B).

W tkankach nowotworowych, które zachowały zdolność ekspresji symportera sodowo-jodkowego (66,7%) i pendryny (73%) obserwowano zmienioną lokalizację białek. Pozytywną reakcję o różnej intensywności dla obu badanych transporterów obserwowano głównie w cytoplazmie tyreocytów (ryc. 3 C, D).

Jony jodkowe dostarczane są do koloidu w dwóch etapach. Z krwioobiegu są aktywnie transportowane do wnętrza tyreocyta a następnie przenoszone są przez błonę szczytową do koloidu, gdzie ma miejsce biosynteza hormonów tarczycy. Białkami katalizującymi transport jonów jodkowych są NIS oraz pendryna. Białka te zlokalizowane są w błonie podstawnej i szczytowej wysoko spolaryzowanej komórki nabłonka tarczycy.

W zróżnicowanych rakach tarczycy obserwuje się nieprawidłowy metabolizm jonów jodkowych a opisywany poziom ekspresji białek, które odpowiedzialne są za transport I^- w tyreocycie charakteryzują często kontrowersyjne dane. Badania in vitro wykazały podwyższoną, niezmienioną lub obniżona ekspresję NIS w rakach tarczycy. Dane dotyczące ekspresji genu PDS kodującego pendrynę są również niejednoznaczne. Donoszono że w rakach tarczycy poziom ekspresji genu PDS jest niewiele obniżony lub znacznie zredukowany w porównaniu do poziomu obserwowanego w tkankach prawidłowych (14,18, 19, 20, 23, 24). Nieprawidłowości w ekspresji zarówno genu NIS jak i PDS mogą być w istotny sposób związane i współodpowiedzialne za nieprawidłowy metabolizm jodu obserwowany w rakach tarczycy.

W niniejszej pracy metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym wykryto transkrypt genów NIS i PDS we wszystkich analizowanych tarczycach prawidłowych i rakach a poziom ekspresji analizowanych transporterów charakteryzowały duże indywidualne różnice. W niektórych nowotworach poziom mRNA symportera sodowo-jodkowego i pendryny był na bardzo niskim poziomie praktycznie na granicy czułości metody. Badania Tanaki i wsp. oraz Arturi i wsp. wykazały również wysoce heterogenną ekspresję NIS podobną do obserwowanej w niniejszej pracy (23, 25). Podobnie w zróżnicowanych rakach tarczycy obserwowano heterogenną ekspresję genu PDS, ale jak wykazały nasze badania oraz Porra i wsp, w większości przypadków mRNA PDS był zbliżony do poziomu obserwowanego w tarczycach prawidłowych (14, 20, 21).

Jakkolwiek poziom transkryptów NIS i PDS w zróżnicowanych rakach tarczycy jest obniżony w porównaniu do tkanek prawidłowych to jednak nie stwierdzono istotnie statystycznych korelacji pomiędzy ekspresją NIS i PDS w poszczególnych przypadkach zarówno w tarczycach prawidłowych jak i w rakach. Wyniki te sugerują, że ekspresja badanych transporterów jest niezależna od siebie, co może być w części wynikiem różnych czynników regulujących ekspresję badanych transporterów (6).

Poza obniżoną ekspresją obu bada-nych transporterów jodkowych w zróżnicowanych rakach tarczycy obserwuje się również zmiany lokalizacji komórkowej tych białek. Wykazaliśmy wcześniej, że zarówno symporter sodowo-jodkowy jak i pendryna w większości raków tarczycy, które zachowały zdolność ekspresji tych białek, lokalizują w błonach cytoplazmatycznych (14, 16). Nieprawidłowa lokalizacja NIS w zróżnicowanych rakach tarczycy była już wcześniej opisywana, natomiast cytoplazmatyczna lokalizacja pendryny została opisana po raz pierwszy przez nasz zespół (14, 26).

Zmieniona lokalizacja obu transpor-terów jodkowych w zróżnicowanych rakach tarczycy sugeruje, że białka te w komórkach nowotworowych nie funkcjonują prawidłowo. Cytoplazmatyczną lokalizację PDS obser-wuje się w przypadku niektórych mutacji genu PDS występujących w zespole Pendreda (5). Badania in vitro wykazały, że aktywność pendryny zależna jest od prawidłowej lokalizacji komórkowej białka (5). Jakkolwiek nie znany jest dokładny mechanizm powodujący zmianę lokalizacji pendryny w zróżnicowanych rakach tarczycy to jednym z nich mogłyby być mutacje. Podobnie w przypadku białka NIS nie są znane mechanizmy odpowiedzialne za jego wewnątrzkomórkową lokalizację w rakach tarczycy. Jak wykazano aktywność białka pendryny i NIS są związane z prawidłową ich lokalizacją stąd zaburzony metabolizm I^- w zróżnicowanych rakach tarczycy może być wynikiem zarówno obniżonego poziomu ekspresji obu genów jak i nieprawidłowej lokalizacji białkowych produktów tych genów (5).

W przeciwieństwie do raków w prawidłowej tarczycy NIS i pendryna zlokalizowane są w błonie podstawnej i szczytowej nabłonka tarczycy (18, 17, 19, 14, 16). Taka lokalizacja białek umożliwia komórce tarczycy ukierunkowany transport jonów jodkowych z krwioobiegu do koloidu. Jak pokazały nasze wcześniejsze badania w prawidłowej tarczycy ekspresja NIS i pendryny jest heterogenna i zróżnicowana na poziomie nie tylko całych pęcherzyków ale i pojedynczych komórek (14, 16). Wydaje się zatem, że poziom ekspresji NIS i pendryny w tkankach prawidłowych tarczycy związany jest z różnym stopniem pobudzenia metabolicznego tyreocytów.

Otrzymane przez nas wyniki wykazują, że większość zróżnicowanych raków tarczycy zachowuje zdolność ekspresji NIS i pendryny – białek zaangażowanych w transport jonów jodkowych. Poziom ich trans-kryptów jest jednak silnie obniżony w porównaniu do tkanek prawidłowych. Ponadto w większości pozytywnych przypadków oba białka zlokalizowane są cytoplazmatycznie, co sugeruje, że transformacja nowotworowa komórek tarczycy wpływa na ich prawidłową translokację do błony podstawnej i szczytowej tyreocyta.

Rola nieprawidłowej lokalizacji obu białek w zróżnicowanych rakach tarczycy wymaga dalszych badań.