Sygnał regulujący szlaki metaboliczne w komórkach tarczycy dochodzi poprzez receptor tyreotropiny (TSHR) po związaniu hormonu tyreotropiny (TSH), fizjologicznego stymulatora tarczycy. Poziom TSH w surowicy oznacza się przy użyciu bardzo czułych testów immunochemicznych, różnicujących normę (1-18 pmol/L, 0,3-5 mU/L) od niższych poziomów w nadczynności i wyższych w niedoczynności tarczycy. Metodą, która pozwala na określenie aktywności biologicznej TSH, a także innych aktywatorów jest pomiar ich wpływu na aktywność cyklazy adenylanowej w prezentujących receptor TSH komórkach ssaków. Najczęściej do tego pomiaru wykorzystywane są komórki jajowe chomika chińskiego (CHO) (1,2) z wbudowanym genem kodującym receptor. Rzadziej, aktywność biologiczną mierzono przez pomiar cyklazy adenylanowej w izolowanych komórkach tarczycy świni (3). Wykonanie obu powyższych oznaczeń wymaga wyspecjalizowanych laboratoriów, tak więc w sposób rutynowy nie bada się aktywacji komórek tarczycy przez TSH.

U chorych z chorobą Gravesa-Base-dowa występują autoprzeciwciała, któ-re są patologicznymi stymulatorami tar-czycy, a stymulacja jest skutkiem połą-czenia się autoprzeciwciała z recepto-rem TSH. Autoprzeciwciała stymulujące (TSAb) są oligoklonalne, a więc wytwarzane przez kilka klonów limfocytów B, należą do podklasy IgG1 (4) i występują w surowicy w bardzo małych ilościach (5) co wskazuje, że zostały wytworzone we wczesnych okresach procesu autoimmunizacyjnego. U chorych występują też autoprzeciwciała, które wiążą się z receptorem ale go nie aktywują, natomiast uniemożliwiają związanie TSH. Są to autoprzeciwciała blokujące (TBAb), powodujące niedoczynność w chorobie Hashimoto. Te autoprzeciwciała są poliklonalne (6,7). W surowicy konkretnego chorego mogą występować zarówno autoprzeciwciała stymulujące jak i blokujące, a także neutralne, nie posiadające aktywności biologicznej.

Poziom autoprzeciwciał w surowicach chorych wyznacza się na podstawie siły z jaką hamują wiązanie znakowanego TSH do receptora. Dostępne komercyjnie testy są oparte na tej zasadzie i nie pozwalają na rozróżnienie autoprzeciwciał stymulujących od blokujących (8). Być może będą one zmodyfikowane przez zastąpienie znakowanego TSH przeciwciałem monoklonalnym (9), co w dalszym ciągu nie pozwoli jednak na rozróżnienie aktywności auto-przeciwciał. To rozróżnienie może dać zbadanie wpływu autoprzeciwciał na aktywność cyklazy adenylanowej w komórkach prezentujących receptor: wzrost poziomu cAMP wskaże na obecność przeciwciał stymulujących, natomiast brak zmian poziomu cAMP w obecności przeciwciał i TSH wskaże na obecność przeciwciał blokujących (10). Najnowsze podejście do badania przeciwciał antyreceptorowych przedstawia praca poglądowa prof. Bernarda Rees Smith i wsp. opublikowana w Thyroid (11).

Niskie stężenie autoprzeciwciał u chorych bardzo utrudnia dokładniejsze poznanie epitopów na cząsteczce re-ceptora rozpoznawanych przez te autoprzeciwciała i dokładniejsze zbadanie interakcji autoprzeciwciał z receptorem. W tym celu pomocne są przeciwciała monoklonalne. W wyniku immunizacji myszy różnymi preparatami błonowymi otrzymano cały szereg przeciwciał monoklonalnych. Wszystkie przeciwciała otrzymywane w początkowym okresie, do roku 1996 blokowały receptor. Dopiero zastosowanie do immunizacji zmodyfikowanych fibroblastów prezentujących zarówno TSHR jak i antygeny zgodności tkankowej klasy II, (12) pozwoliło na uzyskanie przeciwciał stymulujących. Następne przeciwciała stymulujące o wysokim powinowactwie i mianie uzyskano w kilku pracowniach przy zastosowaniu immunizacji genowej (13-16)

Największy postęp w tłumaczeniu procesu wiązania się autoprzeciwciał z receptorem przyniosły wyniki badań ludzkich przeciwciał monoklonalnych. W 2003 otrzymano ludzkie przeciwciało monoklonalne (M22) o aktywności stymulującej (17). Przeciwciało to pochodziło z namnożonych przy użyciu wirusa Epstein Barr limfocytów krwi obwodowej pacjenta z chorobą Gravesa-Basedowa. Techniką immunoenzymatyczną (ELISA) stwierdzono konkurencję M22 i autoprzeciwciał pacjentów w wiązaniu z receptorem TSH, przy czym dotyczyło to zarówno autoprzeciwciał o aktywności stymulującej jak i hamującej. Autoprzeciwciała od ponad 100 chorych hamowały wiązanie M22 z siłą, która korelowała z ich aktywnością w hamowaniu wiązania TSH, co sugerowało bliską relację rejonów receptora oddziałujących z autoprzeciwciałami, z M22 i z TSH. Wykonanie oznaczeń z dobrze scharakteryzowanym ludzkim monoklonalym przeciwciałem stymulującym, jakim jest M22 pozwoliło wyznaczyć stężenia autoprzeciwciał stymulujących u chorych na 50-500 ng/ml (0,33-3,3 nmol/L). Stężenie to jest porównywalne do stężenia TSH powodującego nadczynność tarczycy podobną do nadczynności chorych na chorobę Gravesa-Basedowa (18).

Ostatnio otrzymano również ludzkie przeciwciało monoklonalne o aktyw-ności blokera (5C9) (19). Hamowało ono zarówno wiązanie jak i stymulację komórek przez TSH, przez M22, przez surowice pacjentów i przez mysie antyreceptorowe przeciwciała monoklonalne. Tak jak w przypadku M22 konkurencja dotyczyła zarówno przeciwciał o aktywności stymulującej jak i blokującej. Wyniki te sugerowały podobieństwo epitopów rozpoznawanych przez różne autoprzeciwciała. W rzeczywistości jednak autoprzeciwciała od poszczególnych chorych cechuje znaczna zmienność. Na istnienie różnic, ale też i podobieństw, w epitopach wskazują między innymi wyniki doświadczeń z mutacjami. Po wprowadzeniu punktowych mutacji do cząsteczki TSHR aktywność stymulująca autoprzeciwciał pacjentów zmienia się w różny sposób. Ze zbadanych mutacji wyjątkiem była mutacja reszty R255 w receptorze, która uniemożliwiała wiązanie autoprzeciwciał stymulujących wszystkich chorych, nie wpływając na wiązanie TSH ani na wiązanie autoprzeciwciał blokujących. Tak więc do terapii pacjentów, u których nadczynność jest spowodowana obecnością autoprzeciwciał stymulujących należałoby wprowadzić czynnik specyficznie blokujący tą resztę (11).

Błonowy receptor TSH należy do dużej grupy receptorów współdziałających z regulatorowym białkiem G. Bardzo szczegółowy model TSHR opracowany z zastosowaniem najnowszych programów komputerowych zaproponowali Miguel i wsp. (ryc. 1A) (3). Model ten w znacznej mierze pokrywa się z wcześniejszymi modelami opartymi na analogiach budowy kolejnych części cząsteczki receptora z budową związków które zostały wykrystalizowane i których struktura została wyznaczona na podstawie dyfrakcji promieni X. Z 744 reszt aminokwasów budujących receptor, 397 reszt stanowi część pozakomórkową a pozostałe część transbłonową i cytoplazmatyczną receptora. W części pozakomórkowej wyróżnić można fragment N-końcowy, bogaty w cysteiny, który ma strukturę podobną do występującej w naskórkowym czynniku wzrostu (20), fragment bogaty w leucyny (LRD, reszty 58-277), którego struktura została zaproponowana na podstawie struktury inhibitora rybonukleazy (21), i fragment „zawiasowy”. Dwa pierwsze z tych fragmentów i część fragmentu „zawiasowego” tworzy podjednostkę A receptora. Mniej wiadomo o strukturze a również i o funkcji fragmentu „zawiasowego”. W wyniku posttranslacyjnego dojrzewania receptora część tego fragmentu obejmująca reszty aminokwasowe 313-371, nazwana Peptydem C uwalniana jest z receptora, w wyniku czego receptor przyjmuje formę dimeru (22).Ta modyfikacja nie obniża wiązania TSH i autoprzeciwciał przez receptor. Receptor zarówno w formie monomeru jak i dimeru stabilizowany jest przez mostki dwusiarczkowe 241-390 i 301-408. Ich redukcja powoduje uwolnienie podjednostki A receptora. Wykazano, że wolna podjednostka A wiąże autoprzeciwciała silniej niż cały receptor (23). Fragment pozakomórkowej części receptora przylegający do błony cechuje obecność jednej struktury beta i jednej helisy alfa.

Dla części transbłonowej receptora przyjęto strukturę rodopsyny w której 21% sekwencji aminokwasów jest identycznych do sekwencji występujących w TSHR. Cechą charakterystyczną tej części jest obecność siedmiu, przechodzących przez błony alfa helis oraz łączących je pętli pozabłonowych i cytoplazmatycznych, podobnie jak w innych receptorach współdziałających z regulatorowym białkiem G. Krótka część cytoplazmatyczna receptora jest zaproponowana również na podstawie budowy rodopsyny. Część transbłonowa i cytoplazmatyczna receptora łącznie z krótkim fragmentem pozakomórkowym (do aminokwasu 370) stanowi podjednostkę B receptora. Na tym modelu receptora autorzy umieścili cząsteczkę TSH (3). Przy tworzeniu modelu kompleksu TSH-TSHR uwzględniono uprzednio uzyskane dane eksperymentalne takie jak: udział reszt 246--260, 277-296 i 381-385 w wiązaniu TSH i w wiązaniu autoprzeciwciał, mutacje Ser 281 i mutacje aminokwasów domeny transbłonowej prowadzące do wzrostu aktywności podstawowej cyklazy adenylanowej, różnice w wiązaniu z receptorem cząsteczek ludzkiego TSH (hTSH) oraz TSH ze świń i z wołów oraz dane dotyczące wiązania gonadotropiny kosmówkowej (hCG). Opracowany model uwidocznił bezpośredni kontakt lub utworzenie wiązania wodorowego pomiędzy aż 74 konkretnymi resztami aminokwasowymi domeny LRD i dodatkowo 14 resztami z fragmentu „zawiasowego” receptora z odpowiednimi resztami w cząsteczce hTSH. Ponadto uwidocznił występowanie 15 aminokwasów obdarzonych ładunkiem w na tyle bliskim sąsiedztwie TSH, że może dojść do utworzenia wiązań jonowych.

Nieco inny model kompleksu TSH-TSHR uwzględniający podobieństwa i różnice w wiązaniu hormonów glikoproteinowych TSH, LH, FSH i hCG z odpowiednimi receptorami oraz dane dotyczące wiązania tych hormonów z receptorami o mieszanej budowie (chimerycznymi) zaproponowali Moyle i wsp. (24). Model uwzględniał obecność szeregu reszt o ładunku dodatnim bliżej końca karboksylowego domeny LRD, które oddziałują z konserwatywną resztą asparaginy w hormonach. W modelu tym zwrócono uwagę na zmiany, które zachodzą po dołączeniu TSH; związanie hormonu zwiększa przestrzeń pomiędzy aminowym końcem części zawiasowej i domeną LRD oraz powoduje przesunięcie tej domeny w stosunku do domeny TMB i to pozwala na przeniesienie sygnału.

Każdy z powyższych modeli wskazuje nieco inne ułożenie cząsteczki TSH w stosunku do receptora, natomiast oba modele, zgodnie z wcześniejszymi wskazują na domenę LRD jako podstawę do wytworzenia kompleksu.

Końcową odpowiedź na pytanie o strukturę trzeciorzędową związków może dać analiza ich struktury krystalicznej. Receptor TSH jest związkiem bardzo labilnym i ulega denaturacji na różnych etapach oczyszczania. Prawdopodobnie z tego powodu dotychczas nie udało się wykrystalizować cząsteczki receptora ani w formie wolnej, ani w kompleksie z TSH. Zaobserwowano natomiast, że znacznie stabilniejszą strukturę ma pozakomórkowy fragment receptora, obejmujący aminokwasy 1-260 (TSHR260). Uprzednio stwierdzono już (25, 23), że ten fragment receptora obejmujący znaczną część podjednostki A wiązał bardzo silnie autoprzeciwciała chorych. Używając tą część domeny pozabłonowej receptora TSH udało się w 2007 roku wykrystalizować kompleks receptora z przeciwciałem monoklonalnym M22 (ryc. 1B) (26).

Komórki owadzie transferowane bakulowirusem kodującym łańcuch 1-260 reszt aminokwasowych receptora TSH (TSHR260) inkubowano z fragmentem Fab wyizolowanym z przeciwciała M22 a następnie z płynu hodowlanego izolowano i oczyszczano wytworzony tam kompleks. Kompleks M22-TSHR był zadziwiająco trwały, wytrzymał kilka etapów oczyszczania i krystalizację. Pojedynczy kryształ o wymiarach 0,02x0,02x0,05 mm składał się z prawie całego fragmentu Fab M22 (reszty 1-208 łańcuchów lekkich i reszty 1-127, 134-213 łańcuchów ciężkich) oraz prawie całej cząsteczki TSHR260 (reszty 30-257). Ponadto kryształ zawierał 6 reszt N-acetyloglukozaminy, 289 cząsteczek wody i jony cynku, które wprowadzono dla ułatwienia oczyszczania kompleksu. Badanie kryształu metodą dyfrakcji promieni X wykazało, że receptor ma kształt lekko zagiętej spiralnej rury utworzonej z LRD, której wklęsłą powierzchnię stanowi 10 skrętów o strukturze beta, a powierzchnię wypukłą 8 krótkich zagięć tworzących również strukturę beta. Nie stwierdzono obecności uprzednio proponowanych w tym obszarze helis alfa. Na wypukłej powierzchni rury rozmieszczone są miejsca glikozylacji, a wewnętrzna powierzchnia zawiera reszty hydrofobowe. Pomiędzy N-końcowymi cysteinami 31 i 41 wytworzony jest mostek dwusiarczkowy. Oba łańcuchy, ciężki i lekki łańcuch fragmentu Fab kontaktują się z wklęsłą powierzchnią rury przy czym łańcuchy Fab umieszczone są mniej więcej prostopadle do tej powierzchni. W interakcję z receptorem w większym stopniu zaangażowane są łańcuchy ciężkie, w mniejszym łańcuchy lekkie Fab. Ze strony receptora w wiązaniu uczestniczą reszty we wszystkich 10 strukturach beta. Pomiędzy ligandami występują różnorodne oddziaływania: 22 wiązania wodorowe i mostki solne, 14 wiązań wodorowych poprzez cząsteczkę wody, polarne oddziaływania bez wytworzenia mostków wodorowych zachodzące pomiędzy 15 resztami z każdej strony, oddziaływana niepolarne zachodzące pomiędzy 12 resztami, i 5 wiązań Wan der Waalsa. Stwierdzono, że elektrostatyczny potencjał: dodatni ładunek bliżej N końca wklęsłej powierzchni LDR, a ujemny bliżej C końca jest komplementarny do potencjału stykających się z nim fragmentów Fab. Wyniki powyższej analizy wykazują, że powierzchnia oddziaływań M22 z receptorem jest wyraźnie większa niż typowo obserwowana dla autoprzeciwciał.

Otrzymanie i scharakteryzowanie kryształów TSHR260-M22 jest olbrzymim postępem w zrozumieniu aktywacji TSHR również przez TSH. Szereg informacji wskazuje na podobieństwo oddziaływań M22-receptor do oddziaływań TSH-receptor, czy w szerszym pojęciu oddziaływań hormon-receptor. Takie informacje uzyskano porównując kryształ kompleksu M22 z receptorem i otrzymany w roku 2005 kryształ kompleksu folitropiny z receptorem (FSH-FSHR276) (27). W obu tych kryształach komplementarne z ligandami powierzchnie rozłożone były podobnie. Stwierdzono jednak też i różnice w budowie kompleksu M22 z receptorem czy TSH z receptorem. Różnicującym przykładem są wyniki doświadczenia w którym w kolejnych cząsteczkach receptora wprowadzono inne punktowe mutacje i stwierdzono, że tylko jedna z mutacji obniżała w sposób drastyczny stymulację cyklazy adenylanowej przez TSH, podczas gdy 14 mutacji znacznie obniżało lub uniemożliwiało stymulację receptora przez M22 (26). Tak więc TSH i autoprzeciwciała pacjentów wykorzystują w reakcji z receptorem miejsca zlokalizowane w tym samym rejonie receptora i znacznie zachodzące na siebie, lecz nieco inne.

Dokładne poznanie miejsc kluczowych dla wiązania autoprzeciwciał może mieć implikacje kliniczne. Jak już podawałam, proponuje się, że takim miejscem jest reszta R255 w receptorze, krytyczna do wiązania wszystkich autoprzeciwciał stymulujących, natomiast nie uczestnicząca w wiązaniu TSH. Otrzymanie pochodnej niskocząsteczkowej wiążącej ten aminokwas, mogłoby mieć znaczenie terapeutyczne (11).

Grupa badaczy z Niemiec podeszła inaczej do poszukiwania związków które mogą mieć zastosowanie terapeutyczne. Badano następny etap w stymulacji receptora-przeniesienie sygnału z części pozabłonowej na helisy transbłonowe. Receptory katecholamin, należące do tej samej co TSHR grupy receptorów współdziałających z białkiem G, wiążą hormony poprzez reszty aminokwasów budujących helisy transmembranowe. Uwzględniając możliwość interakcji tego rodzaju dla hormonów glikoproteinowych i ich receptorów przeprowadzono badania w których wykazano, że niskocząsteczkowy związek tienopirymidyna (org 41841) (ryc. 2) jest agonistą receptora LH/hCG. Związek ten nie współzawodniczył w wiązaniu LH z receptorem, sugerowano więc wiązanie z fragmentem transbłonowym. Następnie wykazano, że ten sam związek działa również jako aktywator TSHR stymulując cyklazę adenylanową w linii embrionalnych komórek nerki (HEK-EM 283) prezentujących TSHR. Uzyskiwana stymulacja stanowiła 23% maksymalnej stymulacji receptora przez TSH tak więc org 41841 zachowywał się jak jego częściowy agonista. Analiza modelu TSHR wykazała, że org 41841 lokuje się w „kieszeni” pomiędzy helisami transbłonowymi 3, 4, 5, 6 i 7 oraz drugą pętlą pozakomórkową. Kieszeń jest stosunkowo duża, z kolejnych helis tworzy ją po 5, 3, 8, 7 i 2 aminokwasy, a dodatkowo uczestniczy w niej 6 aminokwasów z drugiej pętli pozakomórkowej (28). Ostatnio w innych badaniach również wykazano udział dynamicznej interfazy pomiędzy transmembranową helisą 6 i drugą pętlą pozakomórkową w regulacji aktywności cyklazy adenylanowej (29). Wprowadzając mutacje w cząsteczce rekombinowanego RTSH na błonach komórek HEK uzyskano analog receptora z 9 mutacjami, którego stymulacja przez org 41841 stanowiła aż 99% stymulacji przez TSH. Wprowadzone zmiany to przede wszystkim zastąpienie pięciu aminokwasów resztami mniej hydrofobowymi i usunięcie jednej z prolin, która „uściślała” cząsteczkę receptora. W konsekwencji powiększyło to ładunek i miejsce na dołączenie liganda jakim był org 41841.

Wyniki uzyskane w powyższej pracy są bardzo interesujące i bardzo zachęcające. Są to pierwsze dane wskazujące na możliwość bezpośred-niej aktywacji TSHR przez związek niskocząsteczkowy. Ponadto uzyskane dane świadczą o tym, że różne struktury chemiczne odległe budową od budowy hormonu mogą imitować jego aktywność biologiczną. Org 41841 aktywuje TSHR zbyt słabo, aby mógł być stosowany w klinice. Jednak uzyskane wskazówki, które z reszt receptora tworzą „kieszeń” i które zawadzają, uniemożliwiając pełne wykorzystanie tej „kieszeni”, mogą pozwolić na syntezę cząsteczki o nieco innej, bardziej pasującej do receptora budowie.

W bieżącym roku wyznaczono strukturę aż 49 związków niskocząsteczkowych stymulujących TSHR (30).