Konferencja odbywała się w dniach 22-24 września 2005 roku w południowej dzielnicy Aten – Glyfadzie, położonej nad Zatoką Sarońską Morza Śródziemnego i zgromadziła badaczy nie tylko z Europy, ale i ze Stanów Zjednoczonych. Konferencję poprzedził dwudniowy kurs metodyczny cytometrii przepływowej, a zakończyły „Warszaty cytometryczne”.

Przedstawiane referaty i prace były oparte przede wszystkim o metodykę analizy cytofluorometrycznej, która w ostatnich latach przechodziła dynamiczny i wielostronny rozwój.

Główna tematyka demonstrowanych referatów plenarnych, doniesień ustnych oraz sesji wybranych plakatów dotyczyła:

– oznaczania choroby resztkowej w białaczkach ostrych i przewlekłych

– oznaczania immunofenotypu komórek w zespołach mielodysplastycznych

– oznaczania komórek śródbłonka w krwi obwodowej, jako wskaźnika angiogenezy w rozwoju nowotworów oraz jako wskaźnika uszkodzeń naczyń krwionośnych w chorobach układu krążenia

– oznaczania populacji komórek o niskiej liczebności, np. subpopulacji limfocytów T zróżnicowanych funkcjonalnie, poprzez określenie ekspresji receptorów chemokin czy komórek dendrytycznych w krwi obwodowej

– oznaczania kinazy ZAP-70, jako czynnika rokowniczego w przewlekłej białaczce limfocytowej

– oznaczanie granulocytów zasadochłonnych w rozwoju alergii

– uściślania metod (tzw. protokołów) oznaczania komórek macierzystych/progenitorowych w transplantacji.

Oznaczanie choroby resztkowej (MRD- minimal residual disease) było omawiane w ostrej białaczce szpikowej (OBS), w ostrej białaczce limfoblastycznej (OBL) oraz w szpiczaku plazmocytowym (Multiple myeloma – MM).

W pracy pochodzącej z ośrodka w Amsterdamie stwierdzono, że oznaczanie choroby resztkowej w OBS powinno następować po wszystkich cyklach chemioterapii, a jako granicę krytyczną uznano obecność 0,1% komórek białaczkowych. Powyżej tej granicy zachodzi wysokie prawdopodobieństwo wznowy, a u części chorych wznowa pojawiała się bardzo szybko. Niestety, jeśli poziom MRD jest mniejszy niż wartość graniczna nie oznacza to wykluczenia wznowy, bowiem u 20% chorych wystąpiły jej objawy.

Identyfikacja komórek białaczki szpikowej w poszukiwaniu MRD metodą cytometrii przepływowej jest ułatwiona w przypadku występowania tzw. aberrantnych ekspresji molekuł powierzchniowych, która w prawidłowej mielopoezie nie występuje. Ostatnio opisano nową molekułę powierzchniową typu lektyny: C-type lectin like molecule-1 (CLL-1), która jest specyficzna dla komórek linii mieloidalnej w ostrej białaczce szpikowej i być może stanie się ona przydatnym elementem identyfikacji białaczkowych mieloblastów.

Pomocne może być także oznaczanie receptora CD184 dla chemokiny – SDF-1 (czynnika podścieliska), którego ekspresja na komórkach białaczkowych towarzyszy wysokiej liczebności mieloblastów, a zwłaszcza monoblastów w szpiku chorych na białaczkę mielomonocytową lub monoblastyczną, co było przedmiotem przedstawianej pracy z Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie.

W poszukiwaniu choroby resztkowej w ostrej białaczce limfoblastycznej pre-B OBL badacze węgierscy zaproponowali włączenie do procesu identyfikacji limfoblastów białaczkowych, poza rutynowym oznaczeniem cyTdt/CD19/CD10, analizy wewnątrzkomórkowej ekspresji czynnika XIII krzepnięcia krwi, jako ekspresji aberrantnej obecnej w licznych przypadkach.

W szpiczaku plazmocytowym prof. Orfao (Hiszpania) przedstawił zastosowanie czterokolorowej fluorocytometrii w badaniu szpiku u chorych po leczeniu w celu odróżnienia plazmocytów szpiczaka od prawidłowych i oznaczeniu choroby resztkowej:

CD19-/CD56++/CD38+/CD45-+ vs CD19+CD56-/CD38++/CD45+.

Stwierdził ponadto, że u chorych na szpiczaka (od 20% do 33% przypadków) aberrantna ekspresja molekuł: CD20, CD28, CD33 i CD117 ułatwia monitorowanie leczenia i oznaczanie choroby resztkowej, ale wiąże się z krótszym okresem wolnym od choroby.

Problem zastosowania cytometrii przepływowej w diagnozowaniu MDS interesująco omówiła dr Stetler-Stevenson z Narodowego Instytutu Raka (NCI) w Bethesda (USA), która wymieniła najważniejsze odchylenia immunofenotypu komórek mieloidalnych w MDS w porównaniu do prawidłowego dojrzewania granulocytów. I tak zwróciła uwagę na asynchronię ekspresji CD11b i CD16, zmienioną intensywność ekspresji CD13 i CD71 w porównaniu do prawidłowo różnicujących się komórek oraz częsty brak ekspresji CD33 na komórkach linii mielomonocytarnej w MDS lub dodatkowe występowanie ekspresji CD56.

Liczne aberracje immunofenotypu komórek linii mieloidalnej w MDS pozwalają zatem odróżnić MDS od innych procesów chorobowych, jednakże warunkiem określenia tych specyficznych odchyleń jest zastosowanie dużej liczby przeciwciał w panelu diagnostycznym.

Możliwość oznaczania w krwi obwodowej komórek śródbłonka opiera się na stosowaniu cytometrii przepływowej panelu przeciwciał przeciw markerom tych komórek, tj. CD45-, CD146+, CD105+. Liczebność komórek śródbłonka w krwi u chorych z nowotworami jest wyższa aniżeli u chorych z remisją a także u ludzi zdrowych. Ma to związek z angiogenezą w rozwoju nowotworu, bowiem stwierdzono, że po podaniu talidomidu - uznanego czynnika antyangiogennego – maleje liczba komórek śródbłonka i wzrasta gwałtownie liczebność śródbłonkowych komórek apoptotycznych. Według badaczy z Europejskiego Instytutu Onkologii w Mediolanie oznaczanie liczebności komórek śródbłonka w krwi obwodowej wykazuje dużą przydatność w monitorowaniu terapii antyangiogennej i określaniu odpowiedzi klinicznej na leczenie nowotworu.

W chorobach układu krążenia np. po zawale lub w zaawansowanej w chorobie wieńcowej ważne jest oznaczenie liczebności progenitorowych komórek śródbłonka; chodzi w tym przypadku o określenie możliwości regeneracyjnych uszkodzonego śródbłonka ścian naczyń krwionośnych. Obecnie uważa się, że immunofenotyp komórek progenitorowych śródbłonka charakteryzuje ekspresja: CD34, CD133 i receptora dla czynnika wzrostu śródbłonka (Vascular Epithelium Growth Factor) – VEGR2. Jak podsumował McCoy z Narodowego Instytutu Zdrowia w Bethesda, jest to analiza trudna metodycznie, ze względu na konieczność zagęszczania badanej próbki krwi i brak szczegółowo uzgodnionego protokołu badania.

Obecnie można różnicować limfocyty T krwi obwodowej, poza limfocytami pomocniczymi CD4+ i cytotoksycznymi CD8+, na wiele subpopulacji w zależności od ich stopnia dojrzałości, a także odmienności funkcjonalnych. Stadia dojrzewania limfocytów T charakteryzuje zróżnicowana ekspresja molekuł kostymulacyjnych (np. CD28) oraz receptorów chemokin, co wiąże się ze specyficznymi drogami migracji tych komórek podczas odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty T naiwne (CD27++CD28+) wykazują ekspresję receptora CCR7 dla chemokiny CCL21 (obecnej w węzłach limfatycznych) i CXCR4 dla chemokiny SDF-1(czynnika podścieliska), co wskazuje na ich recyrkulację pomiędzy węzłami chłonnymi a krwią obwodową. Ostatecznie zróżnicowane limfocyty T (CD27-CD28-), zwłaszcza cytotoksyczne CD8+, mają receptory CXCR1 i CXCR2 dla chemokiny CXCL8 (tj. cytokiny IL-8) i chemokiny CXCL3, związanej z rozwojem nowotworu.

Oznaczanie receptorów chemokin ma także znaczenie w rozrostach z limfocytów T, pozwala bowiem oceniać zdolność komórek nowotworowych do migracji i naciekania tkanek i narządów. W pracy pochodzącej z kilku klinik hematologicznych w Portugalii wykazano na nowotworowych limfocytach T w chłoniaku T komórkowym i w prolimfocytowej białaczce z komórek T (PLL-T) ekspresję receptora CCR4 dla chemokin wydzielanych przez komórki skóry oraz CCR6 dla chemokin wątroby, co wskazuje na skłonność do infiltracji tych narządów.

Istotne dla monitorowania chorób o podłożu autoimmunologicznym jest oznaczanie subpopulacji limfocytów T regulacyjnych, stanowiących część limfocytów pomocniczych tj. CD4+CD25++. Jak wynika z pracy badaczy greckich ze szpitala Uniwersyteckiego w Janina nad chorobą Hashimoto związaną z defektem tolerancji immunologicznej, w określaniu liczebności tej subpopulacji jest ważne wyodrębnienie komórek CD4+ z bardzo silną ekspresją łańcucha, a receptora dla IL-2 czyli CD25 (średnia intensywność ekspresji – MFI – powyżej 100). Badacze ci zaobserwowali, że tylko silna ekspresja świadczy o właściwościach regulacyjnych limfocytu CD4+ czyli efektywnym hamowaniu aktywności immunosupresyjnych cytokin IL-10 i TGF-.

Na Konferencji przedstawiono też kilka prac dotyczących oznaczania komórek dendrytycznych w krwi obwodowej metodą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem ekspresji charakterystycznych markerów dla komórek dendrytycznych typu mieloidalnego (CD83+CD11c+) i plazmacytoidalnego (CD83+ CD123+). Komórki CD83+ stanowią bardzo mało liczną populację: u osób zdrowych średnio 0,25%±0,15% komórek układu białokrwinkowego, a u chorych hematologicznych (np. na szpiczaka plazmacytowego liczba jest jeszcze niższa.

Obecnie wyróżnia się dwa rodzaje PBL-B: ze zmutowanymi i z niezmutowanymi genami IGVH, która charakteryzuje się gorszym rokowaniem. Z kolei ZAP-70 to kinaza tyrozynowa zaangażowana w szlak sygnalizacyjny w limfocytach T i komórkach NK, a także obecna w nowotworowych komórkach B. Z dotychczasowych badań wynika, że wysoki odsetek przypadków PBL-B z niezmutowanymi genami IGVH wykazuje obecność ZAP-70 (około 70%-80%) i od kilku lat oznaczanie tej kinazy tyrozynowej jest uważane przez hematologów-klinicystów za przydatny wskaźnik rokowniczy w PBL-B.

Jednakże procedura metodyki oznaczania ZAP-70 jest ciągle przedmiotem dyskusji badaczy pracujących nad ustaleniem standardu metody analizy cytometrycznej. Wyniki uzyskane w laboratoriach w Europie, w Stanach Zjednoczonych i w Australii różnią się w zależności od zastosowanego przeciwciała czy marki cytometru. Na podstawie wielu opinii dr Kraan z Rotterdamu podsumował, że oznaczając ZAP-70 w komórkach PBL-B należy określać średnią intensywność fluorescencji (tzw. MFI – mean fluorescence intensity) przy zastosowaniu przeciwciała Alexa 488. Pojawiła się również nowa propozycja oznaczania lipazy lipoproteinowej jako wskaźnika prognostycznego w PBL-B, lecz na razie niewiele wiadomo na temat przydatności klinicznej tego oznaczenia i niektórzy uważają, że trzeba nadal posługiwać się analizą ZAP-70.

Metody cytometrii przepływowej są od niedawna stosowane w badaniu rozwoju alergii, a stało się to możliwe dzięki wprowadzeniu oznaczania na powierzchni granulocytów zasadochłonnych markerów identyfikujących te komórki tj. głównie CD203c. Ekspresja CD203c jest podwyższona na bazofilach (w porównaniu do kontrolnych granulocytów zasadochłonnych) w stanach alergicznych po ugryzieniu przez osy i pszczoły, a także w reakcjach uczuleniowych na kurz i pyłki traw, co obserwowano w Instytucie Medycyny Chorób Wewnętrznych w Tubingen. Ponadto ekspresja innej molekuły: CD63 pozwala określić stan aktywacji granulocytów zasadochłonnych, co zanotowano m.in. w reakcji uczuleniowej na antybiotyki b-laktamowe. Metoda cytometrii przepływowej oznaczania aktywowanych bazofili poprzez ekspresję CD63 została określona przez alergologów z Hiszpanii jako bardziej czuła niż „klasyczna” metoda oznaczania poziomu IgE w stanach alergicznych.

Obecnie prowadzone są wieloośrodkowe badania nad standaryzacją metody oznaczania aktywowanych granulocytów zasadochłonnych CD203c+CD63+, jako komórek odpowiedzialnych za wydzielanie histaminy, co jest warunkiem koniecznym przy wprowadzeniu tego testu do badań rutynowych.

Od wielu lat metoda cytometrii przepływowej jest praktycznie jedyną metodą pozwalającą ustalić liczebność komórek macierzystych/progenitorowych w szpiku, krwi pępowinowej lub w krwi obwodowej poddanej procesowi mobilizacji tych komórek czynnikami wzrostu w procesie transplantacji komórek krwiotwórczych. Procedura oznaczania jest ustalona na poziomie międzynarodowym w postaci odpowiednich protokołów, które są oparte na wykorzystaniu ekspresji molekuły powierzchniowej CD34, występującej na większości tych komórek. Jednakże ze względu na to, że populacja komórek krwiotwórczych jest niecałkowicie jednorodna pod względem stopnia rozwoju proponowane są oznaczenia innych molekuł. Według badaczy z Nijmegen w Holandii stosowanie analizy ekspresji CD133 i CD117 pozwala określić komórki macierzyste na wczesnym stadium dojrzałości tj. CD133+/CD117-/CD34- oraz CD133+/CD117+CD34-, których największy odsetek stwierdzili wśród komórek szpiku.

Jako podstawa opracowania posłużyły materiały „5^th Euroconference on Clinical Cell Analysis” oraz streszczenia przedstawianych prac opublikowane w Cytometry (Part.B. Clinical Cytometry), 2005, 67B, 33-53.