Toczeń rumieniowaty układowy (TRU) jest przewlekłą, autoimmunologiczną chorobą, w której dochodzi do uszkodzenia wielu narządów. Nie ustalono do tej pory bezpośredniej przyczyny choroby. Uważa się, że na jej rozwój mają wpływ predyspozycje genetyczne, zaburzenia immunologiczne, wpływ środowiska zewnętrznego czy zaburzenia hormonalne. Za podejrzeniem tła genetycznego choroby przemawiają obserwacje kliniczne potwierdzające rodzinne występowanie TRU. U chorych z rozpoznanym TRU stwierdza się defekty genetyczne, które prowadzą do obniżenia składowych układu dopełniacza, takich jak C1q, C2, C3, C4. Centralnym punktem rozwoju reakcji zapalnych jest układ dopełniacza, którego główną funkcją jest chemotaksja (opsonizacja i aktywacja komórek, zapoczątkowanie reakcji nabytej oraz liza komórek docelowych). Zmniejszone stężenie w surowicy składników dopełniacza może prowadzić do gromadzenia się w komórkach ciałek apoptotycznych, nadmiaru kompleksów immunologicznych i rozwoju licznych stanów zapalnych (1). Do zaburzeń immunologicznych występujących w przebiegu choroby zaliczyć możemy obecność przeciwciał przeciw dsDNA (przeciwciała przeciw dwuniciowemu DNA), obecność przeciwciał przeciw Sm (anty-Smith), obecność przeciwciał antyfosfolipidowych oraz obecność przeciwciał przeciwjądrowych (ang. anti-nuclear antibodies – ANA) w mianie uznanym za nieprawidłowe.

Składowa C1q należy do klasycznej drogi aktywacji dopełniacza, jej upośledzenie zaburza fagocytozę kompleksów immunologicznych (2, 3, 4), które pozostając w krążeniu mogą powodować lub nasilać autoagresję. Geny kodujące składową C1q dopełniacza znajdują się w regionie 1p34-36. Dziedziczony niedobór C1q dopełniacza występuje u chorych na TRU i jest dowodem na znaczenie tej składowej dopełniacza w patogenezie reakcji autoimmunizacji skierowanej przeciwko strukturom jądra komórkowego. Składowa C1q dopełniacza wraz z DNAzą I degradują chromatynę pochodzącą z komórek, które ulegają martwicy. Deficyt C1q dopełniacza prawdopodobnie jest najsilniejszym czynnikiem ryzyka TRU (OR prawie 10) (5, 6), podobnie jak. choć w nieco mniejszym stopniu niedobór składnika C2 (OR ok. 4,5) (7) oraz C4A i C4B (OR ok. 1,5-5) (8). Martens HA i wsp. (9) nie stwierdzili wpływu polimorfizmu genu C1q rs292001 na stężenie C1q w grupie chorych na TRU, podczas gdy Racilla i wsp. taką zależność wykazali (10). Liczne badania sugerują udział różnych genów w patogenezie TRU, kilkanaście doniesień dotyczy polimorfizmu genu składowej C1q, żadna z tych prac nie opisuje ryzyka rozwoju TRU obejmującego polimorfizmu C1q rs292001 w populacji polskiej.

Celem badania było określenie częstości występowania polimorfizmu genu składowej C1q dopełniacza (rs292001) w polskiej populacji chorych na toczeń rumieniowaty układowy oraz u zdrowych osób.

Badanie uzyskało zgodę Komisji ds. Etyki i Badań Naukowych przy Uniwersytecie im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Wszystkie osoby biorące udział w badaniu zostały poinformowane o założeniach badania oraz jego przebiegu i wyrazili świadomą pisemną zgodę na udział w badaniach.

Grupę kontrolną stanowiło 101 zdrowych dawców krwi (51 kobiet i 50 mężczyzn), kobiety w wieku 19-43 lata oraz mężczyźni w wieku 19-51 lat. Kryteriami wykluczającymi w tym badaniu były choroby autoimmunologiczne, nowotwory, niewydolność układu oddechowego, układu krążenia, nerek, wątroby, ostre i przewlekłe zakażenia i zapalenia. Grupa chorych obejmowała 98 nie spokrewnionych chorych na TRU, rasy kaukaskiej, pochodzenia polskiego, w wieku od 20 do 70 lat, (60 kobiet i 38 mężczyzn). Rozpoznanie ustalono na podstawie kryteriów klasyfikacji TRU wg ACR (ang. American College of Reumatology) (11). U chorych rozpoznano chorobę, jeżeli zostało spełnione co najmniej 4 z 11 kryteriów w chwili badania lub w wywiadzie. Każdy chory został poddany szczegółowej ocenie klinicznej obejmującej badanie podstawowe i przedmiotowe. Stopień aktywności TRU, określono na podstawie skali aktywności tocznia rumieniowatego układowego (systemic lupus erythrodermatosus activity index – SLEDAI) (12). Niską aktywność choroby stwierdzono u 53% pacjentów, u 34% pacjentów średnią, a u 13% wysoką aktywność choroby. We krwi pacjentów oznaczono metodą immunofluorescencji pośredniej miano przeciwciał przeciwjądrowych oraz zbadano metodą Euroline (Euroimmun, Niemcy) obecność przeciwciał przeciwko rozpuszczalnym antygenom jądra komórkowego. Materiałem do badań genetycznych było DNA wyizolowane z leukocytów krwi żylnej pobranej do probówek zawierających 10% EDTA. DNA zostało wyizolowane z leukocytów krwi obwodowej metodą wysalania. Genotypowanie wykonano przy użyciu metody tetra-primer ARMS PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy). Metoda ta została wykorzystana ze względu na brak możliwości dobrania enzymu rozpoznającego analizowane miejsce polimorficzne. W reakcji tetra-primer ARMS PCR użyto następujących starterów:

Forward inner (G allele):

AGACCAGAAGGATCACATAGACATTTGAAG

Reverse inner (A allele):

ATGTAGGATGCCCGGATGCAAATGAT

Forward outer (5’-3’):

CTCTGAGCCTAAGTGGGCTCATCTGTAA

Reverse outer (5’-3’):

AAGTGGAGAGAAGTGTGAACAGGCACTT

Na poszczególnych etapach warunki reakcji przedstawiały się następująco: denaturacja wstępna przez 3 min w temperaturze 95°C, namnażanie produktu reakcji (35 cykli): 30 s w temperaturze 95°C, 30 s w temperaturze 65,9°C oraz 30 s w temperaturze 72°C, faza końcowej syntezy produktu reakcji odbywała się przez 10 min w temperaturze 72°C. Reakcje PCR przeprowadzono na termocyklerze Mastercycler ep firmy Eppendorf. Produkt analizy został rozdzielony na 2% żelu agarozowym.

Analizę rozkładu częstości genotypów przeprowadzono za pomocą pakietu statystycznego Statistica 7.1., stosując test zgodności chi-kwadrat Pearsona, a analizę rozkładu częstości alleli – z wykorzystaniem testu dokładnego prawdopodobieństwa Fishera. Dla analiz przyjęto jako istotny statystycznie poziom istotności p < 0,05. W przypadku grup o liczebności mniejszej niż 5 zastosowano test dokładnego prawdopodobieństwa Fishera – Frimana – Haltona. Stwierdzono, że prawo Hardy’ego-Weinberga dla badanych alleli zostało zachowane.

W badanej grupie chorych przeciwciała typu ANA wykryto u 60 chorych, przeciw dsDNA u 27 chorych, natomiast przeciwciała przeciw nukleosomom były obecne u 26 pacjentów. Przeciwciała anty-Sm stwierdzono tylko u 3 chorych, przeciw-SSA (ang. Sjögren’s antibodies) u 31 chorych, natomiast przeciwciała anty-SSB (ang. Sjögren’s antibodies) były obecne u 13 pacjentów. Przeciwciała przeciw RNP (ang. Ribonucleoprotein antibodies) wystąpiły u 13 chorych, przeciwciała przeciw histonom u 10 pacjentów, przeciwciała przeciw rybosomalnemu białku P pojawiły się u 4 osób z toczniem rumieniowatym układowym.

W wyniku przeprowadzonej analizy restrykcyjnej produktu reakcji tetra primer ARMS PCR, otrzymano 3 warianty polimorficzne genu C1q (rs292001): homozygotę GG, heterozygotę AG oraz homozygotę AA. W grupie kontrolnej polimorfizm AG stwierdzono u 49 osób, polimorfizm GG u 35 osób, natomiast polimorfizm AA u 17 osób. W badanej grupie chorych polimorfizm AG wystąpił u 55 pacjentów, polimorfizm GG u 32 chorych na TRU, natomiast polimorfizm AA wystąpił u 11 pacjentów. Rozkład poszczególnych genotypów i alleli występujących u pacjentów oraz w zdrowej kontroli zawarte są w tabeli 1.

Wysoką aktywność choroby stwierdzono u 14 osób z polimorfizmem GG, u 1 osoby z polimorfizmem AA oraz u 17 pacjentów z polimorfizmem AG. Podwyższone miano przeciwciał typu ANA stwierdzono u 7 osób z polimorfizmem GG, u 3 pacjentów z polimorfizmem AA oraz u 10 osób z polimorfizmem AG. W badanym polimorfizmie genu kodującego C1q (rs292001) rozkład genotypów nie różnił się statystycznie istotnie w grupie pacjentów z niską aktywnością choroby i u chorych na TRU o średniej i wysokiej aktywności (p > 0,05).

W przeprowadzonych badaniach nie znaleziono statystycznie istotnych zależności wskazujących na powiązanie polimorfizmu składowej C1q (rs292001) z występowaniem TRU. Wyniki analizy statystycznej przedstawia tabela 2.

Badania nad genetycznym podłożem rozwoju tocznia rumieniowatego układowego prowadzone są od lat. Harley J.B. i wsp. (13) obserwowali rodzinne występowanie choroby i współzależność pojawiających się zmian genetycznych. Udowodnili, że toczeń nie jest chorobą zdeterminowaną przez jedną zmianę w pojedynczym locus. W swoich badaniach zajmowali się położeniem polimorfizmów na wirtualnej mapie ludzkiego genomu. Znajomość dokładnego położenia markerów genetycznych ułatwia zrozumienie złożonego schorzenia jakim jest toczeń rumieniowaty układowy (13). Namjou B. i wsp. (14) prowadzili badania nad dziedzicznymi niedoborami składowej C1q układu dopełniacza, oceniając polimorfizmy występujące w genie kodującym C1q, dotyczące łańcuchów A, B i C. Przebadali 17 pojedynczych nukleotydowych polimorfizmów w populacji Afroamerykanów i Hiszpanów. Analizy ilościowe pokazały, że niektóre pojedyncze nukleotydowe polimorfizmy w genie C1q mogą być powiązane ze stężeniem składowej C3 w surowicy. Udowodnili, że polimorfizmy w genie kodującym C1qA są powiązane z fenotypami tocznia rumieniowatego układowego w tych dwóch badanych populacjach (14). Chew H. i wsp. (15) badali metodą PCR – RFLP pojedyncze nukleotydowe mutacje C1q u malezyjskich pacjentów chorych na toczeń rumieniowaty układowy. Zajmowali się siedmioma typami mutacji w genie kodującym C1q, które są zlokalizowane w: C1qA – Gln186 (C > T), C1qB – Gly15 (G > A), C1qB – Arg150 (C > T), C1qC – Gly6 (G – A), C1qC – Arg41 (C > T) oraz dwoma pojedynczymi nukleotydowymi polimorfizmami: C1qA – Gly70 (G/A), C1qC – Pro14 (T > C). Stwierdzili, że niedobór C1q nie jest głównym czynnikiem genetycznym powodującym TRU w populacji malezyjskiej. Celem naszego badania było określenie częstości występowania polimorfizmu C1q (rs292001) w polskiej populacji chorych na toczeń rumieniowaty układowy. Nie stwierdziliśmy istotnych różnic w częstości występowania badanego polimorfizmu w populacji zdrowych osób w porównaniu do grupy chorych. Częstości występowania poszczególnych polimorfizmów AA, GG oraz AG były podobne w obu badanych grupach. Chew H. i wsp. badali również i nie stwierdzili żadnych związków klinicznych i laboratoryjnych obserwowanych w genotypach i allelach u pacjentów chorych na toczeń rumieniowaty układowy oraz żadnych w przypadku mutacji występujących w C1qA – Gly70 (G/A) i C1qC – Pro14 (T > C) SNPs. Nasze badania również nie potwierdziły istotnych zależności między badanym polimorfizmem C1q (rs292001) a wynikami badań laboratoryjnych.

Martens H.A. i wsp. (9) badając polimorfizmy C1q rs631090 u chorych na toczeń rumieniowaty układowy stwierdzili, że ma on związek z chorobą i stężenie tej składowej w surowicy u chorych na toczeń rumieniowaty układowy maleje. Jednak badana przez nich populacja była mała. W przypadku rs292001 składowej C1q nie stwierdzono związku z stężeniem C1q w surowicy ale okazało się, że polimorfizm ten ma związek z ciężkim przebiegiem choroby (9). W naszych badaniach nie korelowano surowiczego stężenia C1q z występowaniem polimorfizmu w obrębie C1q, gdyż składnik C1q zawarty w surowicy jest zmienny i nie udało sie uzyskać wystarczająco dużej grupy chorych o stałym niezmiennym stężeniu surowiczego C1q. Natomiast w naszym badaniu nie stwierdzono pozytywnych zależności między aktywnością choroby a badanym polimorfizmem. Sontheimer R.P. i wsp. (16) prowadzili badania nad funkcją składowej C1q oraz jej rolą w autoimmunizacyjnym toczniu. Składowa C1q wpływa na immunoregulację. Świadczy o tym fakt, że u więcej niż 90% osób z wrodzonym niedoborem C1q rozwija się wczesna światłowrażliwa postać tocznia rumieniowatego układowego. Badacze udowodnili, że pojedynczy nukleotydowy polimorfizm może być przyczyną subtelnych różnic w ekspresji C1q i tym samym czynnikiem ryzyka rozwoju choroby(16). Berkel A.I. i wsp. (17) prowadzili genetyczne i epidemiologiczne badania dotyczące selektywnych niedoborów C1q w populacji tureckiej, zajmując się głównie polimorfizmem C > T. Przebadano pacjentów z różnych ośrodków i w różnym wieku. Badacze ci stwierdzili, że niedobór C1q może zwiększać ryzyko wystąpienia objawów tocznia rumieniowatego układowego (18). W naszych badaniach przeprowadzonych na populacji polskiej nie znaleziono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów polimorfizmu C1q składowej dopełniacza rs292001 między grupą pacjentów chorych na TRU a grupą kontrolną zdrowych osób.

Brak różnic w częstości występowania polimorfizmu składowej C1q rs292001 między badaną grupą chorych na TRU a grupą kontrolną może świadczyć o braku wpływu tego polimorfizmu na rozwój TRU w polskiej populacji, jak również o dużej różnorodności czynników genetycznych zaangażowanych w patogenezę choroby.