Technikę cytometrii przepływowej (flow cytometry – FC) w badaniach krwinek czerwonych zastosowano po raz pierwszy w 1980 roku (1). Oceniano liczbę cząsteczek IgG autoprzeciwciał na krwinkach osób chorych na niedokrwistość autoimmunohemolityczną. Cztery lata później za pomocą FC wykrywano krwinki płodu w krążeniu matki, a w kolejnym roku technikę tę wykorzystano w badaniach antygenów grup krwi, w tym ekspresji antygenów układu Rh w zależności od ich homo- lub heterozygotyczności (2-4).

Metoda cytometryczna pozwala na badania fenotypowe, czyli wykrywanie i identyfikację antygenów krwinek czerwonych za pomocą skierowanych do nich swoistych przeciwciał oraz ocenę mieszanych populacji erytrocytów (5-7). Jest dynamicznie rozwijającą się techniką diagnostyczną, umożliwiającą precyzyjną ocenę pojedynczych komórek przy jednoczesnej analizie dużej ich liczby. W cytometrze krwinki płyną jedna za drugą, a na każdą z nich pada wiązka światła laserowego umożliwiając zróżnicowanie poszczególnych frakcji za pomocą parametrów morfologicznych: wielkości FSC (Forward Scatter Channel) i ziarnistości SSC (Side Scatter Channel) (ryc. 1).

Erytrocyty tworzą dobrze wyodrębnioną, oddzielną populację krwinek, gdy przedstawia się je na wykresie kropkowym tzw. „dot-plot” używając skali logarytmicznej (8), co potwierdzają nasze doświadczenia (ryc. 2).

W celu wykrycia poszukiwanego antygenu znakuje się erytrocyty specyficznymi przeciwciałami, sprzężonymi z odpowiednimi fluorochromami. Zazwyczaj są nimi fikoerytryna (PE) oraz izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Barwniki te wzbudzane przez laser argonowy emitują odpowiednio światło pomarańczowe oraz zielone, przy czym fluorescencja PE daje silniejszy sygnał niż FITC. Do oznaczania frakcji retikulocytów stosuje się barwnik, który wykrywa fragmenty kwasów nukleinowych, pozostających w tych komórkach np. oranż tiazolu (9, 10). Fluorochromy ulegają wzbudzeniu, a intensywność fluorescencji odpowiada ekspresji antygenu. Zależy ona jednak nie tylko od liczby miejsc antygenowych na komórce, ale także od stopnia powinowactwa użytego przeciwciała, czyli siły jego wiązania z determinantami antygenowymi, metody znakowania komórek (bezpośrednia ze znakowanymi swoistymi przeciwciałami lub pośrednia ze znakowanymi przeciwciałami anty-IgG skierowanymi do swoistych nie znakowanych przeciwciał) oraz zastosowania odpowiednich fluorochromów. Różnorodność barwników umożliwia dobór odpowiedniej siły świecenia w zależności od gęstości badanego antygenu i zgodnie z zasadą, że do wyznakowania niezbyt licznych struktur o małej gęstości determinant antygenowych, stosuje się silne fluorochromy i odwrotnie dla dużej ich liczby stosuje się fluorochromy słabe.

Wykorzystując cytometrię do badań antygenów grup krwi, uzyskano wyniki średniej liczby antygenów oraz stopień zróżnicowania ich gęstości na erytrocytach. Stwierdzono, że antygeny o strukturze węglowodanowej (A, B, H, I, i, P) są bardziej zróżnicowane pod względem gęstości (od kilkudziesięciu determinant do setek tysięcy) niż np.: antygeny układów Rh, Kell, Duffy, Kidd (kilkanaście, rzadko kilkadziesiąt tysięcy) (8, 11). Prowadzono też badania dotyczące zmian liczby antygenów A i B z układu ABO oraz związanego z nimi antygenu H z układu H podczas starzenia się erytrocytów, u noworodków oraz u chorych na białaczki mieloblastyczne. We wszystkich wymienionych przypadkach stwierdzono osłabioną ekspresję tych antygenów (12-16).

Nieliczne publikacje donoszą o użyciu cytometrii przepływowej do oceny liczby i rozkładu miejsc antygenu RhD (16, 17). Badano także antygeny Fy^a i Fy^b z układu Duffy, w związku z ich funkcją receptorową dla pierwotniaka malarii Plasmodium vivax. Stwierdzono wyższą ekspresję tych antygenów na retikulocytach niż na krwinkach dojrzałych (19).

Metoda cytometryczna, jako bardzo czuła, jest stosowana do poszukiwań lub potwierdzania obecności nowych antygenów i układów grupowych. Donoszą o tym między innymi publikacje z 2012 roku dotyczące wykrycia układów Langeries i Junior, omówione w pracy przeglądowej w obecnym numerze „Postępów nauk medycznych”. Ze względu na konieczność przeprowadzenia badań populacyjnych antygenów powszechnych Lan i Jr^a, poszukiwania Jr^a u innych ssaków oraz badań ekspresji antygenów na liniach komórkowych transfekowanych odpowiednimi genami i na ludzkich komórkach nowotworowych, metoda cytometryczna była jedyną metodą immunohematologiczną umożliwiającą przeprowadzenie kompletu badań fenotypowych identyfikujących nowe układy grupowe, które następnie potwierdzono badaniami na poziomie DNA (20, 21).

Do wykrywania przeciwciał związanych z krwinkami czerwonymi stosuje się aglutynacyjne testy antyglobulinowe: bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) do wykrywania przeciwciał związanych z erytrocytami in vivo oraz pośredni test antyglobulinowy (PTA) do wykrywania wolnych przeciwciał w surowicy po związaniu ich in vitro z krwinkami czerwonymi. Technikę cytometryczną stosowano w badaniu erytrocytów chorych na niedokrwistość autoimmunohemolityczną w następujących celach: do ilościowej oceny cząsteczek IgG przypadających na jedną krwinkę, do wykrywania autoprzeciwciał, gdy wynik BTA był słaby lub ujemny oraz do oznaczania podklas IgG. Technikę tę używano obok techniki aglutynacyjnej, immunoenzymatycznej, radioizotopowej, ponieważ żadna z nich nie została uznana za referencyjną (5, 22, 23).

Cytometrię przepływową stosowano także do ilościowej oceny wolnych przeciwciał w surowicy. W latach 90. po raz pierwszy przeprowadzono próby oznaczania IgG anty-RhD u kobiet w ciąży (24, 25). Na podstawie intensywności fluorescencji erytrocytów opłaszczonych przeciwciałami anty-RhD o znanym stężeniu sporządzono krzywą standardową, z której następnie odczytywano stężenia IgG anty-RhD w próbce surowicy konkretnej kobiety. Badanie ilościowe wolnych przeciwciał w krwi matki, a szczególnie obserwacje narastania ich poziomu mają duże znaczenie w prognozowaniu choroby hemolitycznej płodu/noworodka (ChHPN), bowiem przeciwciała te przechodzą przez łożysko i niszczą krwinki czerwone płodu tym silniej im jest ich więcej. Zazwyczaj stosuje się mniej czułe oznaczanie miana przeciwciał w PTA, podając w wyniku największe rozcieńczenie, w którym przeciwciała reagują. Oceniano też cytometrycznie podklasy IgG wywołujących ChHPN, gdyż jest to kolejny czynnik prognostyczny tej choroby. Jednoczesne występowanie IgG1 i IgG3 zazwyczaj prowadzi do ciężkiej postaci choroby, podczas gdy w obecności IgG2 lub IgG4 hemoliza nie powinna wystąpić. Na podobnych zasadach oznacza się cytometrycznie wolne przeciwciała anty-RhD w osoczu immunizowanych dawców krwi, które przeznaczone jest do produkcji immunoglobuliny anty-RhD stosowanej w profilaktyce ChHPN i podawanej kobietom RhD ujemnym po urodzeniu RhD dodatniego dziecka (w niektórych krajach również w ciąży) (26). Ponieważ stężenie wolnych przeciwciał w surowicy można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej dopiero po związaniu ich z krwinkami czerwonymi, to istotny jest dobór odpowiednich krwinek z kontrolowaną liczbą determinant antygenowych. Ocenia się ją cytometrycznie albo badając DNA dawcy w kierunku jego homo- lub heterozygotyczności w zakresie określonego genu (27).

W ocenie mieszanej populacji krwinek czerwonych wykorzystuje się różnice np.: antygenów grupowych, hemoglobiny, enzymów czerwonokrwinkowych (26). Wyznakowane grupy erytrocytów różnią się obecnością lub poziomem fluorescencji, więc można je wykrywać oraz obliczać procentowy udział w mieszaninie.

Przykładem mieszanej populacji krwinek czerwonych są erytrocyty płodowe w próbce krwi matki w ciąży lub po porodzie. W ostatnich latach wzrasta liczba publikacji opisujących zastosowanie cytometrii w badaniach tak zwanego przecieku, czyli krwawienia płodowo-matczynego (foetomaternal haemorrhage – FMH) (28-33). Po raz pierwszy w 1984 roku cytometrycznie oznaczono procent erytrocytów RhD dodatnich płodu w populacji erytrocytów RhD ujemnych matki (2, 3). Zastosowano pośrednią metodę znakowania, czyli najpierw reakcję z przeciwciałami anty-RhD, następnie ze skierowanymi do nich znakowanymi przeciwciałami anty-IgG. W 1996 roku zastosowano bezpośrednie metody znakowania erytrocytów przy użyciu Ig anty-RhD sprzężonych z fluorochromem (34). Stosujemy je obecnie w naszym laboratorium (ryc. 3).

W 1999 roku zaproponowano dodatkowe znakowanie erytrocytów za pomocą swoistej Ig anty-glikoforyna, aby lepiej wyodrębnić płodowe krwinki czerwone na cytogramie (35). Późniejsze badania wykazały, że znakowanie dodatkowym swoistym dla krwinek czerwonych przeciwciałem nie jest konieczne, jeśli stosuje się skalę logarytmiczną dobrze obrazującą erytrocyty za pomocą parametrów morfologicznych (FSC, SSC).

W innej metodzie cytometrycznego oznaczania FMH wykorzystuje się przeciwciała skierowane do hemoglobiny płodowej (HbF) (ryc. 4). Jest ona obecna w krwinkach płodu i ma duże powinowactwo do tlenu, co ułatwia pobieranie go drogą dyfuzji i aktywnego transportu z naczyń krwionośnych matki usytuowanych w łożysku w ścisłym kontakcie z naczyniami krwionośnymi dziecka. HbF posiada w swojej budowie łańcuchy globinowe γ i różni się od hemoglobiny dorosłych (HbA), która posiada łańcuchy β. Od okresu okołoporodowego do około szóstego miesiąca życia HbF jest stopniowo zastępowana przez HbA. Niewielką i zróżnicowaną zawartość tej hemoglobiny można wykryć u zdrowych osób dorosłych oraz w niektórych wrodzonych niedokrwistościach hemolitycznych, co przedstawiono w pracy przeglądowej zamieszczonej w bieżącym numerze czasopisma. Metoda, w której Ig anty-HbF wiążą się z łańcuchami polipeptydowymi γ, polega na wewnątrzkomórkowym znakowaniu erytrocytów i dlatego wymaga ich utrwalenia oraz tak zwanej permeabilizacji, czyli perforacji błony erytrocytów (36). Różni autorzy wskazują, że metoda ta jest czulsza, szybsza i bardziej powtarzalna niż znany od około 60 lat mikroskopowy test Kleihauera-Betke również wykrywający obecność krwinek HbF dodatnich (8, 31). W niektórych krajach, np. w Wielkiej Brytanii i Irlandii test mikroskopowy przeprowadza się u wszystkich kobiet RhD ujemnych w ramach profilaktyki ChHPN. W przypadku oznaczania przecieku płodowo-matczynego ≥ 4 ml potwierdza się go metodą cytometryczną i dobiera się odpowiednio dużą dawkę IgG anty-RhD, aby zneutralizować krwinki RhD płodu w ustroju matki i ochronić ją przed immunizacją (37).

Jednoczesne zastosowanie przeciwciał anty-HbF oraz przeciwciał wykrywających anhydrazę węglanową (carbonic anhydrase – CA) może zwiększać swoistość testu. CA jest enzymem, który pojawia się w okresie okołoporodowym i jest go dużo w krwinkach osób dorosłych oraz bardzo mało lub nie występuje w ogóle w krwinkach płodowych. Podwójne znakowanie umożliwia wyodrębnienie krwinek płodowych HbF dodatnich, CA ujemnych, krwinek matki HbF ujemnych, CA dodatnich oraz tzw. komórek F matki, które są HbF dodatnie i CA dodatnie (38).

Zastosowanie cytometrii przepływowej w ocenie mieszanej populacji krwinek czerwonych może być przydatne podczas obserwacji przeżycia przetaczanych erytrocytów. Metoda ta oparta jest na różnicy antygenów krwinek czerwonych biorcy i dawcy. Próbki krwi biorcy po transfuzji inkubuje się z surowicą zawierającą pierwszorzędowe przeciwciała, a następnie z przeciwciałami anty-IgG sprzężonymi z fluorochromem. Badania te wykonywano dla oceny przeżycia przetoczonych erytrocytów z danym antygenem wykrywanym przy użyciu przeciwciał m.in.: anty-e, anty-Jk^a, anty-Js^b, anty-Lu6, anty-B, anty-Di^b, anty-D (39, 40).

Cytometrię przepływową można również wykorzystać jako czułą metodę do wykrywania allogenicznych transfuzji krwi u sportowców (6). W wyniku przetoczenia krwinek czerwonych zwiększa się poziom hemoglobiny, wzrasta stężenie tlenu i zwiększa się wydolność fizyczna organizmu. Prawdopodobnie pierwsza allogeniczna transfuzja krwi u sportowca została przeprowadzona w 1960 roku na igrzyskach w Meksyku. Cytometrię przepływową do wykrycia tego rodzaju dopingu zastosowano po raz pierwszy w 2004 roku na olimpiadzie w Atenach. Podczas oznaczeń cytometrycznych sprawdzano próbki krwi pobierane w różnych odstępach czasu przed oraz po zawodach. Taką metodą można wykryć dwie populacje krwinek czerwonych różniących się antygenowo, nawet po 3-4 miesiącach po transfuzji, ponieważ czas przeżycia erytrocytów in vivo wynosi ok. 120 dni.

FC wykorzystywana jest w badaniach erytrofagocytozy, czyli niszczenia starych, uszkodzonych lub nieprawidłowych krwinek czerwonych przez monocyty/makrofagi. Komórki te fagocytują erytrocyty opłaszczone cząsteczkami IgG lub białkami układu dopełniacza, gdyż rozpoznają je za pomocą odpowiednich receptorów. Badanie erytrofagocytozy może mieć znaczenie dla prognozowania nasilenia hemolizy w niedokrwistościach autoimmunologicznych typu ciepłego z autoprzeciwciałami klasy IgG, w chorobie hemolitycznej płodu i noworodka, przetaczaniu krwi w obecności przeciwciał do antygenów powszechnych oraz w zakażeniach pasożytniczych krwinek czerwonych przez różne gatunki zarodźca malarii (41-43). Fagocytozę ocenia się ilościowo na podstawie odsetka komórek fagocytujących oraz jakościowo poprzez wzrost intensywności fluorescencji w czasie trwania procesu. W ostatnich latach do znakowania erytrocytów wykorzystuje się fluorochromy PKH (44, 45). Mają one spektra emisji podobne do FITC i PE, wiążą się stabilnie z błoną komórkową, nie powodując zmian w jej strukturze i nie zmieniając funkcji badanych komórek. FC różnicuje populacje komórek żernych oraz fagocytowanych, umożliwia zastąpienie dotychczas stosowanej metody radioizotopowej (42, 43).

Na podstawie analizy około 200 artykułów, opublikowanych przez 88 zespołów stwierdzono, że 75% spośród nich stosuje procedury znakowania erytrocytów właściwe dla krwinek białych, a 25% nie stosuje żadnej metody zapobiegającej aglutynacji, co może być powodem uzyskiwania fałszywych wyników (46). W celu uniknięcia aglutynacji korzystne jest stosowanie znakowanych fragmentów przeciwciał Fab (fragmenty wiążące antygen). Można też stosować różne odczynniki utrwalające komórki, np. glutaraldehyd lub formaldehyd, jednak działania takie mają wpływ na morfologię erytrocytów (7). Inny efekt – autofluorescencja erytrocytów nie zaburza wykrywania komórek z dużą liczbą miejsc antygenowych o silnej fluorescencji, ale może maskować niską intensywność fluorescencji w przypadku małej liczby miejsc antygenowych na krwince. Wadą znakowania pośredniego jest wzrost niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego przez populacje komórek bez antygenu. Innymi najczęściej spotykanymi błędami podczas procedur znakowania erytrocytów są: inkubacja komórek z przeciwciałami w nieodpowiedniej temperaturze, stosowanie niewłaściwych przeciwciał, nieodpowiednie warunki wirowania, czy stosowanie skali liniowej w analizie cytometrycznej parametrów morfologicznych FSC/SSC, zamiast skali logarytmicznej.

W celu oznaczania antygenów erytrocytów metodą cytometryczną należy pamiętać o standaryzacji odczynników polegającej na ustaleniu optymalnego stężenia przeciwciał (6, 7). Największym problemem, dotyczącym zastosowania FC w wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu mieszanych populacji erytrocytów jest brak nieaglutynujących znakowanych przeciwciał, skierowanych do określonych antygenów grupowych krwi.

Pomimo problemów związanych z oznaczaniem cech krwinek czerwonych metodą cytometrii przepływowej, stwarza ona wiele możliwości badawczych, których nie dają inne techniki laboratoryjne. W Polsce FC jest szeroko stosowana w badaniach krwinek białych, szczególnie w immunofenotypowaniu chorób limfoproliferacyjnych i w diagnozowaniu niedoborów immunologicznych, ale bardzo rzadko stosuje się ją w immunohematologicznej ocenie krwinek czerwonych. W naszym zespole podjęto wielokierunkowe badania z zastosowaniem metod FC do oceny krwawienia płodowo-matczynego, starzenia się krwinek czerwonych i ich niszczenia.