Walproinian sodu (VPA) – lek stosowany w leczeniu padaczki, który może wywoływać szereg efektów ubocznych łącznie z zaburzeniami w układzie rozrodczym u ludzi.(1). U kobiet może przyczyniać się do powstania hyperandrogenizmu, zaburzeń miesiączkowania, torbielowatości jajników (2-5), u mężczyzn – do atrofii jąder i obniżenia jakości nasienia (5-7). VPA zarówno u kobiet (2-4), jak i u mężczyzn (6, 7) może przyczyniać się do zaburzeń wydzielania hormonów gonadowych, PRL (8) oraz do zaburzeń w wydzielaniu hormonów tarczycy (9).

Według Tauboll (10) doświadczenia przeprowadzone na zwierzętach powinny stanowić integralną część w badaniach zaburzeń układu rozrodczego występujących w padaczce, ponieważ pozwalają na oddzielenie wpływu padaczki na rozwój zaburzeń w układzie rozrodczym od wpływu stosowanych leków przeciwpadaczkowych.

Przeprowadzone badania na zwierzętach eksperymentalnych bez padaczki wykazały, że długotrwałe podawanie VPA (per os) samcom szczura, myszy (11-15) i kozła (16) prowadziło do zmniejszenia płodności, obniżenia jakości nasienia i atrofii jąder, a u samic szczura do torbielowatości jajników (17-20). Ponadto po długotrwałym podawaniu VPA (per os) obserwowano spadek wydzielania testosteronu i LH u szczurów (14) i u kozłów (16) i również u FSH szczurów (14). Nie zostało to jednak potwierdzone w innych doświadczeniach przeprowadzonych również na szczurach (21). We wcześniejszych naszych pracach wykazaliśmy, że podanie dożylne VPA owariektomizowanym (OVX) samicom szczura już po kilkudziesięciu minutach prowadziło do znamiennego obniżenia w surowicy krwi stężenia gonadotropin, PRL, TSH i GH (22, 23).

Wydaje się, że hamujący wpływ VPA na wydzielanie hormonów przysadkowych może być związany zarówno z bezpośrednim, jak i pośrednim wpływem VPA na przysadkę mózgową szczura. Według Roste i wsp. (21) jedynie przeprowadzenie badań na izolowanych preparatach tkankowych z gonad, przysadki i podwzgórza pozwoli na dokonanie oceny wpływu VPA na wydzielanie hormonów przysadkowo-gonadowych. Wiadomo że zakres terapeutycznych stężeń VPA w surowicy krwi u ludzi podczas leczenia padaczki mieści się w granicach 280 μM-690 μM i odpowiednio w strukturach mózgu w granicach 42 μM-190 μM (24). W warunkach hodowli przedniego płata przysadki szczura wykazano, że VPA w stężeniu 1 μM wywiera bezpośredni hamujący wpływ na wydzielanie ACTH (25). We wstępnych doświadczeniach przeprowadzonych również w warunkach pierwotnej hodowli komórek przedniego płata przysadki, po raz pierwszy wykazaliśmy, że VPA już w stężeniu 1 μM (a więc w stężeniu około 42-190 razy mniejszym od stężenia terapeutycznego w strukturach mózgu leczonych pacjentów) hamuje stymulowane przez GnRH wydzielanie LH z izolowanych komórek przedniego płata przysadki zarówno samca, jak i samicy szczura (26).

W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono prac zajmujących się badaniem wpływu VPA na syntezę i wydzielanie LH, FSH, PRL i TSH z przysadki mózgowej w warunkach hodowli komórkowej.

Celem pracy była ocena bezpośredniego wpływu VPA na wydzielanie i syntezę LH, FSH, PRL i TSH z przysadki w warunkach hodowli komórek przedniego płata przysadki samic i samców szczura.

Doświadczenia przeprowadzono w warunkach hodowli pierwotnej komórek przedniego płata przysadki pozyskanych od dojrzałych płciowo samic szczura owariektomizowanych (OVX) i następnie estrogenizowanych (OVX + E2) oraz jako kontroli od samic szczura OVX traktowanych olejem nie zawierającym estrogenów (OVX + OIL) i samców szczura rasy Wistar. Zwierzęta przebywały w standartowych warunkach laboratoryjnych z wolnym dostępem do paszy granulowanej (Murigran) i wody pitnej (ad libitum).

Procedury eksperymentalne były zatwierdzone przez I Komisję Etyki ds. Doświadczeń na zwierzętach (Instytut Biologii Eksperymentalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie).

Hodowlę pierwotną komórek przysadki mózgowej szczurów przeprowadzono według wcześniej stosowanych metod (27). W skrócie – po uśpieniu szczurów iniekcją dootrzewnową ketaminy szczury dekapitowano i izolowano przednie płaty przysadki. Następnie dwukrotnie przepłukiwano medium DMEM z dodatkiem 1% glutaminy 0,01% zestawu antybiotyków i antybiotyków przeciwgrzybicznych oraz 10% surowicy płodowej cielęcej, po czym w temperaturze 37°C poddano je 15-minutowej dyspersji enzymatycznej w obecności 0,1% trypsyny. W celu inaktywacji trypsyny oraz zdegradowania zniszczonych komórek zawiesinę poddano działaniu 10% FCS z dodatkiem 0,1% DNA-zy. Następnie wykonano dyspersję mechaniczną, rozcierając przysadki na sicie o średnicy oczek 50 μm. Zawiesinę komórek trzykrotnie wirowano w medium preparacyjnym (2000 rpm, 15 min, 25°C) zawieszając otrzymany osad w 10 ml medium inkubacyjnego (DMEM z dodatkiem 10% FCS i 0,01% mieszaniny antybiotyków). Liczebność (5 x 10⁵/ml) i przeżywalność (97%) komórek określono w komorze Buerckera na podstawie ich wybarwienia błękitem trypanu. Hodowle komórkowe prowadzono w dołkach o objętości 1 ml na 24 dołkowych płytkach w inkubatorze w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 przez 48 godzin. Aby ocenić bezpośredni wpływ VPA w zależności od stosowanej dawki na syntezę i wydzielanie LH, FSH, PRL i TSH izolowane komórki przedniego płata przysadki były inkubowane przez 24 godz. w obecności VPA w stężeniach: 10 nM, 100 nM, 1000 nM. Po zakończeniu doświadczenia materiał zabezpieczono do badań i przechowywano w -70°C do czasu wykonania ilościowych oznaczeń hormonalnych. Ocenę wydzielania hormonów przysadki dokonano poprzez oznaczenie stężenia zewnątrzkomórkowego rLH, rFSH, rPRL i rTSH w nadsączu. Ocenę syntezy dokonano poprzez oznaczanie stężenia wewnątrzkomórkowego rLH, rFSH, rPRL i rTSH we frakcji komórkowej. W tym celu według metody opisanej przez Ogura (28) dołki z komórkami zalewano 0,5 ml DMEM z 0,2% TRYTONX-100 i zeskrobywano komórki. Procedurę zeskrobywania powtarzano dwukrotnie i następnie zawiesinę sonifikowano trzykrotnie po 5 sekund. Po odwirowaniu homogenatu komórkowego w 10 000 przez 10 min w 4^oC supernatant zabezpieczano do oznaczeń hormonalnych.

Używane do hodowli media oraz pozostałe odczynniki chemiczne pochodziły z firmy Sigma (Sigma Aldrich Chemie GmbH), płytki do hodowli z firmy Nunc (Thermo Fisher Scientific).

Stężenia rLH, rFSH, rPRL oraz rTSH w próbach badanych oznaczono metodą radioimmunologiczną, wykorzystując odczynniki dostarczone przez dr A.F. Parlowa (NIDDK Betesda, MD). W zastosowanych warunkach analizy oznaczony limit czułości dla badanych hormonów był odpowiednio: LH – 0,1 ng/ml; FSH – 1,25 g/ml; PRL – 0,39 ng/ml oraz TSH – 0,5 ng/ml. Każdy z hormonów oznaczono we wszystkich próbach w jednej serii analiz. Wyznaczony błąd wewnątrz-seryjny dla wszystkich analizowanych hormonów był poniżej 7%. Wyniki z 6-9 pomiarów wykonanych w 2-3 osobnych eksperymentach przedstawiono jako wartości procentowe w stosunku do grupy kontrolnej (średnia ± SEM).

Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu testu Kruskal-Wallis, a następnie testu U Mann-Whitney, korzystając z pakietu statystycznego STATISTICA 7.1 PL.

Granicę istotności statystycznej przyjęto na poziomie 95% (P < 0,05).

Po wykonaniu oznaczeń stężenia LH, FSH, PRL i TSH w nadsączu i we frakcji komórkowej po sonifikacji po 24 godz. inkubacji komórek przysadki szczura (ryc. 1), samicy szczura OVX + E2 (ryc. 2), samicy szczura OVX + OIL (ryc. 3) z VPA w stężeniach: 10 nM, 100 nM i 1000 nM nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w stężeniach zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych LH, FSH, PRL i TSH w porównaniu do wartości kontrolnych.

Mechanizm niekorzystnego działania VPA na układ rozrodczy szczura podobnie jak i u człowieka, nie jest w pełni poznany i prawdopodobnie zależy zarówno od wpływu VPA na poziomie jajników i jąder, jak i na poziomie podwzgórza i przysadki. W warunkach hodowli komórkowej potwierdzono bezpośrednie oddziaływanie VPA na gonady. Wykazano, że VPA hamuje podstawowe i stymulowane przez FSH wydzielanie estradiolu przez komórki pęcherzykowe jajnika świni (29) poprzez hamowanie konwersji testosteronu do estradiolu (30) i pobudza apoptozę poprzez wpływ na aktywność kaspazy-3 (29). Wykazano również, że VPA hamuje stymulowaną podaniem gonadotropiny kosmówkowej sekrecję testosteronu z izolowanych komórek śródmiąższowych jądra (komórki Leydiga) szczura (31).

Potwierdzono również możliwość oddziaływania VPA na podwzgórze. Wykazano, że VPA zwiększa „turnover” GABA w strukturach układu nerwowego i modyfikuje przewodnictwo GABA-ergiczne (24, 32). VPA u niedojrzałych płciowo myszy DBA/2J może zaburzać wydzielanie GnRH poprzez wpływ na interakcje na poziomie neuronów GnRH i neuronów GABA w wyniosłości przyśrodkowej podwzgórza (33), powodując opóźnienie dojrzewania płciowego (33, 34) oraz u dojrzałych samic zakłócać przebieg cyklu rujowego (35).

Potwierdzono również możliwość oddziaływania VPA bezpośrednio na przysadkę mózgową.

W cytowanej we wstępie pracy, w której VPA w stężeniu 1 μM hamował podstawowe wydzielanie ACTH w hodowli komórek przysadki szczura, wykazano również hamujący wpływ VPA na stymulowane przez CRF wydzielanie ACTH. Wykazano również, że VPA w warunkach in vitro już w stężeniu 10 μM hamuje stymulowane przez KCl wydzielanie CRF z izolowanych fragmentów podwzgórza, a w stężeniu 100 μM po 3 godzinach inkubacji obniża poziom mRNA dla CRF (36).

W naszych pilotowych badaniach wykazaliśmy, że VPA już w stężeniu 1 μM hamuje po 3 godz. inkubacji wydzielanie LH stymulowane przez GnRH zarówno u samic, jak i samców szczura (26). W przedstawionej pracy wykazaliśmy, że VPA w 24 godz. inkubacji nie wpływa na podstawowe wydzielanie i syntezę zarówno LH, FSH, jak i PRL i TSH. W warunkach hodowli komórkowej przedniego płata przysadki samców szczura, jak i samic OVX zarówno estrogenizowanych, jak i nieestrogenizowanych.

Ze względu na ograniczony zakres przeprowadzonych doświadczeń przedstawione wyniki nie upoważniają do wyciagnięcia jednoznacznych wniosków dotyczących bezpośredniego działania VPA na wydzielanie LH, FSH, PRL TSH z komórek przedniego płata przysadki samic i samców szczura w warunkach hodowli komórkowej.

Otrzymane wyniki wskazują na to, że VPA w stosowanych stężeniach nie wpływa na podstawową syntezę LH, FSH, PRL i należałoby zbadać w warunkach hodowli komórkowej, czy VPA może hamować stymulowane wydzielanie FSH, PRL i TSH w pierwotnej hodowli komórek przedniego płata przysadki samic i samców szczura.