Biofilm bakteryjny definiowany jest jako ustrukturyzowana społeczność komórek bakteryjnych unieruchomionych w biopolimerowej macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanej przez te komórki. Biofilm jest na trwałe przytwierdzony do podłoża, na którym wzrasta, może być nim materia nieożywiona jak również tkanki organizmu. Występowanie w formie biofilmu pozwala bakteriom na zasiedlanie różnych nisz ekologicznych, a także w wielu przypadkach przetrwanie w niesprzyjających dla pojedynczych komórek warunkach. W środowisku naturalnym ponad 99% bakterii występuje w formie biofilmu. W przyrodzie biofilm zazwyczaj tworzony jest przez kilka gatunków drobnoustrojów. Biofilm powstający na powierzchni materiałów medycznych, wprowadzanych do ciała pacjentów oraz na powierzchni zakażonych tkanek człowieka złożony jest głównie z jednego gatunku bakterii. W rozwoju biofilmu można wyróżnić kilka etapów: adhezję komórek do powierzchni, wytwarzanie mikrokoloni, dojrzewanie biofilmu i odrywanie się powierzchniowych fragmentów biofilmu i/lub pojedynczych planktonicznych komórek. W wyniku adhezji do powierzchni zachodzą istotne zmiany w metabolizmie komórki, polegające głównie na wzmożonej ekspresji genów kodujących wytwarzanie białek zewnątrzkomórkowych oraz substancji polisacharydowych wydzielanych pozakomórkowo (1, 2). Skutkiem tego jest unieruchomienie komórek w macierzy zewnątrzkomórkowej i umożliwienie dalszego kształtowania się biofilmu.

W toku kształtowania się przestrzennej, trójwymiarowej struktury biofilmu dochodzi do stopniowej jego polaryzacji. W wyniku tego procesu, po pewnym czasie można wyróżnić warstwę komórek położonych najbliżej powierzchni, na której powstał biofilm, warstwę środkową – w obrębie, której dochodzi do wytworzenia tzw. kanałów wodnych, umożliwiających swobodny przepływ substancji odżywczych, eliminację szkodliwych produktów metabolizmu, jak również przepływ cząsteczek sygnalnych zaangażowanych w quorum sensing (3, 4). Trzecia warstwa, to warstwa powierzchniowa biofilmu (najbardziej oddalona od podstawy biofilmu) złożona z komórek absorbujących substancje odżywcze ze środowiska. Jest ona jednocześnie najbardziej narażona na działanie różnego rodzaju czynników fizykochemicznych oddziałujących na biofilm, np. przepływ krwi, środki dezynfekcyjne, antybiotyki. Okresowo, z w pełni ukształtowanego biofilmu, z jego części powierzchniowej uwalniane są pojedyncze komórki, a niekiedy nawet większe skupiska komórek. W wyniku przemieszczenia, np. z prądem krwi, mogą one osiedlić się w nowej lokalizacji i dać początek nowemu biofilmowi.

Kluczowe elementy rozwoju biofilmu gronkowcowego są identyczne jak w przypadku innych bakterii. W czasie powstawania i dojrzewania biofilmu zachodzi wiele zmian fizjologicznych w komórkach Staphylococcus aureus, nieobserwowanych w przypadku komórek „wolno żyjących”. Pierwszym etapem jest synteza licznych bakteryjnych powierzchownych substancji rozpoznających adhezyjne molekuły macierzy (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules – MSCRAMMs), które wykazują powinowactwo m.in. do fibronektyny oraz fibrynogenu. Adhezyny warunkują kowalencyjne i niekowalencyjne przyłączanie komórek do powierzchni, na której powstaje biofilm. Faza przyłączania się komórek do powierzchni jest pierwszym i kluczowym etapem tworzenia i dalszego rozwoju biofilmu. S. aureus podobnie jak Staphylococcus epidermidis wytwarza liczne MSCRAMM, które wykazują zdolność do wiązania się z licznymi białkami człowieka, np. fibrynogenem, fibronektyną i innymi. Ekspresja MSCRAMM jest nasilona głównie w początkowym etapie tworzenia biofilmu, gdy gęstość komórek jest niewielka. W miarę wzrostu liczby komórek, na drodze quorum sensing, ekspresją MSCRAMM ulega obniżeniu w wyniku działania systemu agr. Po wstępnej fazie przyłączania się komórek S. aureus do powierzchni podłoża rozpoczyna się faza dojrzewania. Charakterystyczna dla tego etapu jest agregacja komórek, która jest osiągana dzięki różnym cząsteczkom, m.in. białkom adhezyjnym oraz polisacharydowym egzopolimerom. Spośród nich głównym czynnikiem jest polisacharydowa adhezyna międzykomórkowa (PIA), będąca poli-N-acetyloglukozoaminą. Jest to częściowo deacylowany polimer N-acetyloglukozoaminy z wiązaniami β-1,6, który wraz z innymi polimerami, takimi jak kwasy tejchojowe i białka, tworzy główną, pozakomórkową macierz biofilmu gronkowcowego, zwaną także śluzem. Deacylowane obszary N-acetyloglukozaminy pełnią istotną rolę, gdyż nadają elektrododatniego charakteru cząsteczkom, które normalnie są obojętne. W konsekwencji sprzyja to elektrostatycznym oddziaływaniom pomiędzy ujemnie naładowanymi powierzchniami sąsiadujących bakterii. Ekspresja operonu ica podlega regulacji przez liczne czynniki środowiskowe, m.in. stężenie tlenu (w warunkach anaerobowych synteza PIA ulega nasileniu) oraz czynniki autogenne jak białka regulatorowe. Jakkolwiek PIA odgrywa kluczową rolę w tworzeniu biofilmu, nie jest on niezbędnym czynnikiem do jego wytworzenia. Opisano biofilmotwórcze szczepy S. aureus, w których nie stwierdzono obecności genów operonu ica. Uważa się, że w przypadku tych szczepów, rolę PIA przejmują białka adhezyjne, wśród których istotną rolę odrywa produkt genu sasG (Staphylococcus aureus surface protein G), podobny do białka Aap (accumulation-associated protein) S. epidermidis, uczestniczącego w międzykomórkowej adhezji oraz akumulacji (5). Cucarella (6), w badaniach nad biofilmem wytwarzanym przez szczepy S. aureus, które były izolowane od krów z mastitis opisał inne białko zaangażowane w tworzenie biofilmu. Białkiem tym jest Bap (biofilm-associated protein). Homolog genu bap gen bhp stwierdzono w szczepach S. epidermidis izolowanych od ludzi. Jednocześnie homologię białka Bap stwierdzono u innych bakterii, co sugeruje, że rodzina tych białek może mieć istotne znaczenie w tworzeniu biofilmu (7). W międzykomórkowej akumulacji oraz rozwoju biofilmu, biorą także udział białka wiążące fibronektynę FnBPA oraz FnBPB (8). Dalsze etapy budowy wstępnie utworzonego biofilmu, obejmują kształtowanie się jego przestrzennej struktury. Przyjmuje się, że jego organizacja przebiega nieco odmiennie od stosunkowo dobrze scharakteryzowanej struktury biofilmu P. aeruginosa. Wspólną cechą przestrzennego kształtowania biofilmu jest udział cząsteczek zaangażowanych w quorum sensing, którymi w przypadku P. aeruginosa są surfaktanty – ramnolipidy, a u S. aureus peptydy, również o właściwościach surfaktantów. Kolejnym etapem rozwoju biofilmu jest jego rozprzestrzenianie. Jest on ściśle kontrolowany głównie przez system agr (9), na drodze quorum sensing, czego wynikiem jest utrzymanie właściwej grubości już utworzonego biofilmu oraz kolonizacja innych obszarów tkanek. Aktywność agr dotyczy głównie komórek w powierzchniowej warstwie biofilmu. W przypadku mutantów agr, które stanowią do 25% szczepów izolowanych z zakażeń związanych z obecnością biofilmu, obserwowano tworzenie grubszego i bardziej zwartego biofilmu w stosunku do szczepów dzikich. Jednocześnie, agr wpływa także na poziom toksyny ? o właściwościach surfaktantu. W wytworzonym biofilmie dochodzi także do obumierania części populacji komórek. Kontrolowana śmierć komórek bakteryjnych, jako proces analogiczny do apoptozy komórek eukariotycznych, jest przedmiotem licznych kontrowersji. Uważa się, że liza określonej puli komórek biofilmu jest istotna dla jego trwania. Proces autolizy bakterii jest regulowany m.in. przez CidR – regulator hydrolizy mureiny. W wyniku lizy komórek dochodzi do uwolnienia DNA. Uwolnione cząsteczki DNA są istotnym elementem strukturotwórczym biofilmu, ponieważ cząsteczka DNA jest polianionem, a tym samym wykazuje zdolność wiązania innych molekuł biofilmu, podobnie jak w przypadku kwasów tejchojowych (10, 11). Spośród innych czynników wpływających na powstawanie biofilmu gronkowcowego należy wspomnieć o elementach insercyjnych zdolnych do integracji w wybrane obszary DNA. Szeroko rozpowszechniony element insercyjny IS256 może integrować do genów operonu ica, a tym samym upośledzać a nawet uniemożliwiać produkcję PIA (12, 13). W powstawanie i kształtowanie biofilmu, zaangażowane są także inne liczne geny i systemu regulatorowe, które w miarę postępu badań nad biofilmem gronkowcowym ukazują złożoność oraz wieloczynnikowość tego procesu. Badania Sambanthamoorthy (14) wykazały istotną rolę genu msa w tworzeniu biofilmu zarówno w warunkach in-vitro jak i in-vivo, na drodze modulacji ekspresji sarA (staphyloccal accessory regulator) – głównego globalnego regulatora, który wpływa na regulację ekspresji alsS – syntetazy α-acetylacetazy, altA – autolizyny oraz icaA (15). Szczepy S. aureus z mutacją w obrębie genu msa (modulator of sarA) wykazywały pięciokrotnie obniżoną transkrypcję genu sarA. W toku badań nad wytwarzaniem biofilmu przez szczep z mutacją w genie msa wykazano, że mutacja ta wpływa na tworzenie dojrzałego biofilmu, a nie wpływa na początkowy etap jego powstawania, tj. początkową adhezję do powierzchni. Jednocześnie wykazano, że mutanty w genie msa nie są zdolne do wiązania z fibrynogenem przy zachowanej zdolności łączenia się z fibronektyną. Jak wiadomo, wiązanie z fibronektyną przyczynia się do międzykomórkowej akumulacji komórek w biofilmie, co wykazały badania O?’Neill i wsp. (16). Mutacja w genie msa wpływa istotnie także na ekspresję genu arcA kodującego deaminazę arginianową, będącą enzymem szlaku deaminacji argininy, wykorzystywanego do uzyskania energii w warunkach beztlenowych. W tworzenie biofilmu zaangażowane są także geny tcaR – będące regulatorem transkrypcji oraz spxA – mającego funkcję regulatora transkrypcyji (17).

W wytworzonym biofilmie zachodzą również zmiany fizjologiczne reprezentowane przez obniżenie aktywności biosyntetycznej dotyczącej DNA, białek oraz ściany komórkowej, które są charakterystyczne głównie dla komórek wolno rosnących. Ponadto zachodzą zmiany w obrębie metabolizmu oddechowego, które związane są z niską zawartością tlenu – szczególnie w głębszych warstwach biofilmu – w wyniku czego uruchamiane są zastępczo różne fermentacyjne szlaki metaboliczno-oddechowe, np. fermentacji acetoiny. Niezmiernie istotne z medycznego punku widzenia są zmiany fizjologiczne komórek tworzących biofilm prowadzące do wzrostu oporności na antybiotyki i substancje biobójcze biofilmu. Głównymi czynnikami ograniczającymi oddziaływanie wspomnianych substancji na komórki tworzące biofilm są: ograniczenie przez macierz biofilmu dyfuzji substancji biobójczych do komórek bakterii, zmiany w przebiegu i nasileniu procesów metabolicznych, których celem działania są antybiotyki, występowanie subpopulacji opornych na działanie leków przeciwbakteryjnych.

W wyniku przerwania ciągłości tkanek, np. podczas zranienia rozpoczynają się procesy gojenia, w przebiegu których wyróżnić można fazy: zapalną, proliferacji i remodelowania (18). Liczne czynniki mogą zaburzyć prawidłowy proces gojenia. Zalicza się do nich m.in. obecność choroby podstawowej, niedożywienie, a także zakażenia bakteryjne. W zakażeniach ran dominującą rolę ogrywają bakterie z rodzaju Pseudomonas, głównie P. aeruginosa oraz z rodzaju Staphylococcus, głównie S. aureus (19), ale także S. epidermidis i inne gronkowce koagulazo-ujemne. W przypadkach upośledzenia funkcji odpornościowych organizmu, obronna faza zapalna może nie być wystarczająco skuteczna dla eliminacji drobnoustrojów. W takich przypadkach następuje szybki rozwój bakterii, a także wytwarzanie przez nie biofilmu. Wytworzony w ranie biofilm, nie tylko nie jest skutecznie zwalczany przez siły obronne organizmu, ale także wykazuje zwiększoną oporność na działanie antybiotyków i antyseptyków. Przyczynia się to do rozwoju zakażenia przewlekłego i utrudnionego gojenia rany, ze względu na stale utrzymujący się stan zapalny. Według szacunków Narodowego Instytutu Zdrowia w Wielkiej Brytanii, 80% przewlekłych zakażeń związanych jest z powstaniem biofilmu (20).

Ocena zdolności do wytwarzania biofilmu przez metycylino-oporne szczepy Staphylococcus aureus (MRSA) hodowane z zakazeń ran, skóry i tkanek miękkich. Ponadto określenie częstotliwości występowania wybranych genów zaangażowanych w proces adhezji i potencjalnie warunkujących wytwarzanie biofilmu.

Szczepy bakteryjne. 34 szczepy MRSA wyhodowane z wymazów z ran i owrzodzeń (n = 31), aspiratów treści ropnej (n = 2), przedsionek nosa (n = 1) (badanie w kierunku nosicielstwa szczepów MRSA), które badano w Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej Szpitala Klinicznego Dzieciątka Jezus Centrum Leczenia Obrażeń w Warszawie w okresie od czerwca 2005 roku do lutego 2008 roku.

Hodowle bakterii prowadzono przy zastosowaniu standardowych metod mikrobiologicznych. Wrażliwość na metycylinę określono wg zaleceń KORLD (39) metodą dyfuzyjno-krążkową z zastosowaniem krążków antybiogramowych z cefoksytyną 30 μg (Oxoid, Anglia).

Identyfikację drobnoustrojów przeprowadzono przy użyciu testów ID 32 Staph kart GP do identyfikacji bakterii Gram-dodatnich oraz testu aglutynacji lateksowej Staph Slide Kit oraz aparatów: ATB Expression System i analizatora bakteriologicznego Vitek 2. Wszystkie testy były produkcji bioMérieux, Francja. Ocenę zdolności wytwarzania biofilmu przeprowadzono przy zastosowaniu 96 studzienkowych, mikrotitracyjnych płytek polistyrenowych, do których dodawano 190 μl pożywki TSB i inokulowano 10 μl 18-godzinnej hodowli bakteryjnej prowadzonej na pożywce TSB. Płytki inkubowano przez 48 godzin, przepłukiwano jałowym roztworem soli, osuszano w czasie 2 godzin w temperaturze 37°C i wybarwiano roztworem fioletu krystalicznego. Zaadsorbowany przez biofilm barwnik ekstrahowano 96% alkoholem etylowym. Ekstrakt fioletu krystalicznego przenoszono do nowej płytki i dokonywano odczytu absorbancji przy długości fali ? = 595 nm, spektofotometr z filtrem ? = 595 nm (Dynex Technology, USA), wartość tła oznaczono wobec próby odczynnikowej. Szczepy wykazujące absorbancję od 0,100 do 0,299 określono jako „+” (słaba zdolność do wytwarzania biofilmu), w przedziale od 0,300 do 0,499 określono jako „++” (średnia zdolność do wytwarzania biofilmu), w przedziale od 0,500 do 0,699 określono jako „+++” (duża zdolność do wytwarzania biofilmu) i powyżej 0,700 określono jako „++++” (bardzo duża zdolność do wytwarzania biofilmu).

Wykrywanie obecności genów: icaA – kodujący poliasacharydową adhezynę międzykomórkową, fnbA – kodujący A białko wiążące fibronektynę, fnbB – kodujący białko B wiążące fibronektynę, clfA – kodujący białko A wiążące fibrynogen (clumping factor A), clfB – kodujący białko B wiążące fibrynogen (clumping factor B), cna – kodujący białko wiążące kolagen przeprowadzono z zastosowaniem techniki PCR. Wykorzystano sekwencje starterów oraz warunki reakcji opisane przez Ando i wsp. (21, 22).

Wyniki uzyskane przy użyciu techniki PCR wykazały, że wśród badanych szczepów można było wyróżnić 12 wzorów genowych, które nazwano od G0 do G11 (tab. 1). Dominował genotyp G0, zawierający wszystkie badane geny, który zidentyfikowano wśród 14 szczepów oraz G4, u którego występował brak genu icaA, zidentyfikowany u 7 szczepów. Występowanie genów clfA oraz icaA stwierdzono u 73,5% badanych szczepów, genu cna u 85,3% szczepów, genów clfB i fnbB u 91,2% szczepów, a genu fnbA u 94,1%.

Zbadano zdolność do wytwarzania biofilmu przez szczepy MRSA przy użyciu metody spektrofotometrycznej.

Stwierdzono, że wśród badanych szczepów 35,3% szczepów wykazywało słabą, 61,8% średnią i 2,9% dużą zdolność do wytwarzania biofilmu. Nie stwierdzono występowania szczepów o bardzo dużej zdolności do wytwarzania biofilmu. Najniższą zdolność do wytwarzania biofilmu wykazywały szczepy izolowane z aspiratów treści ropnej oraz przedsionka nosa, dla tych szczepów uzyskano wartości absorbancji wynoszące odpowiednio: 0,161; 0,178; 0,197. Analogiczne oznaczenia wykonano dla szczepów o genotypie G4, w przypadku którego nie stwierdzono występowania genu icaA. Stwierdzono, że w przypadku genotypu G4 28,6% szczepów wykazywało słabą, a 71,4% szczepów średnią zdolność do wytwarzania biofilmu. Wyniki badań przedstawiono na rycinie 1.

Narastający problem występowania zakażeń wywołanych przez szczepy MRSA związany jest w dużej mierze z wytwarzaniem przez nie biofilmu. Ponadto wrażliwość na antybiotyki bakterii występujących w biofilmie, różni się od wrażliwości form planktonicznych często wzrostem wartości MIC przekraczającym ponad 100 razy maksymalną dawkę antybiotyku możliwą do zastosowania u pacjenta (23). Stąd w przypadku obecności biofilmu bakteryjnego przeważnie obserwuje się brak skuteczności antybiotyków, bez równoległej interwencji chirurgicznej, polegającej na radykalnym oczyszczeniu miejsca zakażenia wraz z usunięciem przylegających tkanek, a w przypadku wystąpienia biofilmu na powierzchni implantu lub cewnika jego usunięciu. Badania nad biofilmem, w szczególności in-vivo są bardzo trudne, stąd najpowszechniej stosowaną metodą badania zdolności wytwarzania biofilmu przez bakterie jest metoda wykorzystująca polistyrenowe płytki do hodowli komórkowych. Metoda ta jest łatwa i powszechnie stosowana, jednakże niejednorodność w zakresie między innymi: rodzajów podłóż, stosowanych odczynników, metod pomiarowych i innych parametrów stwarza dużą trudność w ocenie analogicznych lub zbliżonych jakościowo i ilościowo wyników prezentowanych przez różnych autorów, czy też różne laboratoria lub placówki naukowe.

Celem poznawczym pracy było również określenie częstotliwości występowania wybranych genów potencjalnie odgrywających rolę w procesie tworzenia biofilmu. Podjęto również próbę oceny korelacji między występowaniem genu lub genów, a zdolnością do wytwarzania biofilmu.

W licznych badaniach wykazano, że gronkowcowe białka: wiążące kolagen, fibronektynę oraz fibrynogen oddziałują i wiążą się z istotnymi białkami macierzy międzykomórkowej na zewnątrz komórki zwierzęcej (24, 25, 26). Rolę wiązania powyższych białek w procesie patogenezy wykazano zarówno in-vitro, jak i w badaniach na modelach zwierzęcych. Białka Cna i FnbA odgrywają dużą rolę w kolonizacji tkanek podczas procesów chorobowych, takich jak np.: zapalenie rogówki, zapalenie kości, a także w zakażeniach związanych z implementacją ciała obcego. Białko ClfA odgrywa kluczową rolę w wiązaniu do fibryny oraz do fibrynogenu (27). W komórkach S. aureus białka adhezyjne, takie jak FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB występują wspólnie z innymi molekułami, obecnymi na powierzchni komórki bakteryjnej, np. PIA – polisacharydowa adhezyna zewnątrzkomórkowa lub białkiem Bap – związanym z procesem tworzenia biofilmu. Zdzalik i wsp. (28) przeprowadzili badania porównawcze na szczepach izolowanych od pacjentów hospitalizowanych (wymazy z powierzchni skóry, ran i zmian głębokich) oraz od pacjentów niehospitalizowanych (wymazy tylko z powierzchni skóry). Stwierdzili, że gen fnbA i cna występowały częściej w przypadkach ran u pacjentów hospitalizowanych. Wśród pacjentów hospitalizowanych gen fnbA występował w ranach i zmianach głębokich u 50,0% szczepów, a gen cna u 72,5% szczepów. Campbell i wsp. (29) w badaniach porównawczych na szczepach MSSA i MRSA (n = 12 MSSA z Ameryki, 34 MSSA z Afryki Południowej i 44 MRSA z Ameryki) izolowanych od pacjentów z powikłanymi zakażeniami skóry i tkanek podskórnych stwierdzili, że wśród szczepów MSSA nie było istotnych różnic w częstotliwości występowania genów fnbA, fnbB, clfA, clfB, icaA. Natomiast odnotowano różnicę w odsetku występowania genu cna – 91,0% u pacjentów z Afryki i 75,0% z Ameryki. W tych samych badaniach oceniono występowanie wyżej wymienionych genów w szczepach MRSA pochodzących tylko z Ameryki. Stwierdzono, że geny clfA, clfB i icaA występowały u wszystkich badanych szczepów, gen fnbB wykazano u 98,0% i gen cna u 55,0% szczepów. Ci sami autorzy wykonywali badania na dużej liczbie szczepów MRSA pochodzących z 21 krajów (522 szczepy) z sześciu kontynentów. Stwierdzili występowanie genu fnbA w 90,2%, clfA w 99,8%, clfB 94,6%, fnbB 95,2%, icaA 96,9% i cna w 6,5% badanych szczepów (30). Inni badacze (31) w badaniach nad CA-MRSA stwierdzili występowanie genu fnbA u 16,7% szczepów, a fnbB u 2,8% szczepów. Jednoczesne występowanie obu genów stwierdzono w 2,8% przypadków. Powyżej przytoczone wyniki badań, mimo że nie pozwalają na jednoznaczne skorelowanie konkretnych genów ze zdolnością bakterii do powodowania ropnych zakażeń skóry i ran, to jednak wskazują na prawdopodobny udział całego ich kompleksu.

1. Stwierdzono, że wszystkie badane szczepy MRSA posiadały zdolność do tworzenia biofilmu.

2. Większość badanych szczepów odpowiedzialnych za zakażenia skóry i tkanek miękkich posiadała komplet lub prawie komplet badanych genów.

3. Występowanie genów odpowiedzialnych za adhezję i ich układ nie korelowały ze zdolnością do wytwarzania biofilmu i ilością wytworzonej w nim biomasy.

4. Szczepy posiadające gen icaA, odpowiedzialny za syntezę PIA, nie wytwarzały większej biomasy w biofilmie od szczepów, które tego genu nie posiadały.