Bakterie należące do gatunku Mycobacterium kanasasii to wolnorosnące prątki należące do grupy Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM). Ich naturalnym rezerwuarem jest głównie woda wodociągowa (1, 3, 4). Prątki te były izolowane z naturalnych zbiorników wodnych, systemów dystrybucji wody pitnej, a także z gleby oraz od niektórych zwierząt rzeźnych (3, 4, 5, 6, 23). Badania oparte na analizie polimorfizmu genu hsp65 pozwalają na wyodrębnienie od 5 do 7 typów M. kansasii (1, 3, 4, 5, 6). M. kansasii jest jednym z najczęściej izolowanych NTM w USA (1, 5). Choroby płuc wywoływane przez M. kansasii obserwowane są także w innych regionach świata, w Europie, w tym w Polsce znacznie częściej na terenach zurbanizowanych niż rolnych (1, 3, 4, 6, 7, 9).

Do czynników ryzyka zakażeń wywoływanych przez M. kansasii zalicza się choroby powodujące zaburzenia czynności układu immunologicznego, powodując obniżoną odporność organizmu. Zaobserwowano zwiększone ryzyko zachorowania u osób cierpiących na pylicę płuc, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP), mukowiscydozę, choroby nowotworowe o charakterze złośliwym, AIDS oraz wśród nosicieli wirusa HIV (1, 5, 7, 3, 6, 9).

Liczba infekcji wywoływanych przez prątki należące do grupy NTM ma tendencję wzrostową (1, 2, 6, 7, 8), wskutek czego schorzenia przez nie wywoływane są istotnym problemem klinicznym. Typowanie szczepów prątków metodami biologii molekularnej jest ważnym elementem kontroli epidemiologicznej.

Konwencjonalne metody identyfikacji i diagnostyki mykobakterii są czasochłonne i wymagające dużego nakładu pracy (8, 10, 11). W identyfikacji prątków z grupy NTM powszechnie stosowana jest analiza PRA-hsp65 (8, 6, 11, 12). Wykorzystuje się również inne metody w oparciu o sekwencjonowanie wybranych fragmentów DNA, real-time PCR, a także testy hybrydyzacyjne, takie jak The AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, CA, USA), Inno LiPA Mycobacteria v2 (Innogenetics, Ghent, Belgia), GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Nehren, Germany) (8, 12, 10, 9). W celach epidemiologicznych stosuje się techniki MIRU-VNTR, rep-PCR, PFGE, RFLP, a także analizy wykorzystujące specyficzne dla danego gatunku rodzaje sekwencji insercyjnych (8, 4, 1, 15).

M. kansasii uważany jest za bardzo zróżnicowany gatunek NTM (4, 6), dlatego istnieje potrzeba skutecznej metody identyfikacji tych prątków, użytecznej również w dochodzeniach epidemiologicznych. Dotychczas nie udało się opracować łatwego i skutecznego testu epidemiologicznego dla M. kansasii. Metody oparte o analizę sekwencji 16S rDNA, amplifikację regionu pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA, badanie polimorfizmu genu kodującego białko szoku cieplnego, a także obecności sekwencji insercyjnej IS1652 nie pozwalają na dostateczne różnicowanie szczepów M. kansasii (4, 23).

W tej pracy proponujemy zastosowanie testu TRS-PCR w analizach różnicowania kolekcji szczepów M. kansasii. Trójnukleotydowe sekwencje powtórzone (TRS – trinucleotide repeat sequences) to powszechne motywy mikrosatelitarne obecne w genomach wielu gatunków drobnoustrojów (21). W przypadku szczepów M. tuberculosis CDC1551, M. tuberculosis H37Rv i M. bovis stwierdzono, że motywy (CGG)_n są nadreprezentowane (22), zaś obecność różnych motywów TRS wykazano także w genomach innych gatunków baterii, np. E. coli, L. momocytogenes, M. tuberculosis, S. enterica (22). W naszych poprzednich badaniach wykorzystaliśmy test TRS-PCR do skutecznego różnicowania szczepów Mycobacterium gordonae (14) oraz uropatogennych szczepów Escherichia coli (13).

W pierwszym etapie określiliśmy przydatność testu do różnicowania kolekcji 48 szczepów M. kansasii. Spośród zastosowanych dziesięciu starterów PCR (tab. 2) wybraliśmy dwa najlepiej różnicujące – zawierające motyw CGG lub CCG. Startery te pozwalają różnicować szczepy M. kansasii, jednakże dla celów epidemiologicznych analizy takie musiałyby być uzupełnione przez dodatkowe metody różnicowania. Ponadto wykazaliśmy skuteczność różnicowania za pomocą metody CGG-PCR takich gatunków prątków jak M. avium, M. gordonae, M. kansasii, M. xenopi, M. tuberculosis i M. intracellulare.

W badaniach wykorzystano 48 szczepów izolowanych od chorych pochodzących z kolekcji Zakładu Mikrobiologii IGiCHP. Kolekcja ta została wstępnie zdefiniowana jako Mycobacterium kansasii na podstawie wyników testu HPLC i GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Nehren, Germany). W badaniach wykorzystano również szczepy: M. avium, M. gordonae, M. kansasii, M. xenopi, M. tuberculosis i M. intracellulare (IGiChP, Warszawa).

Izolację genomowego DNA wykonano metodą z użyciem DNAzolu oraz perełek szklanych według wcześniej opublikowanych procedur (19, 14). Wysuszony osad DNA, zawieszano w 50 μl wody destylowanej (MiliQ Plus, Milipore), a następnie doprowadzano do stężenia około 50 ng/μl.

W pierwszym etapie dokonano amplifikacji fragmentu genu hsp65 (441 pz) według opisanej wcześniej metody (20). Reakcję PCR prowadzono w termocyklerze T-3000 (Biometra). Analizę wielkości i liczby fragmentów powstałych po trawieniu enzymami BstEII i HaeIII (Fermentas), wykonywano na podstawie rozdziałów elektroforetycznych wobec standardu wielkości fragmentów DNA – GeneRuler^TM 50 bp DNA Ladder (Fermantas). Typy profili PRA-hsp65 określano poprzez porównanie danych dostępnych w bazie PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.html).

Reakcje PCR prowadzono według opisanej wcześniej procedury (13, 14) w termocyklerze T-3000 (Biometra). Uzyskane produkty rozdzielano elektroforetycznie w żelach agarozowych (1,6%, TAE), wobec standardu wielkości DNA GeneRuler^TM 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas). Żele barwiono roztworem bromku etydyny, a następnie fotografowano w świetle UV z wykorzystaniem systemu Fc8800 (Alphainnotech).

Analizę komputerową podobieństwa profili prążkowych wykonano za pomocą oprogramowania BioNumerics (Applied Maths) przy zastosowaniu korelacji Pearsona oraz metody UPGMA (13, 14). Wzory prążkowe normalizowano wobec standardu wielkości DNA GeneRuler^TM 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas), zawierającego 14 fragmentów o wielkości od 3000 pz do 100 pz. Siłę różnicowania poszczególnych analiz określano poprzez wyliczenie współczynnika różnicowania (DI – discriminatory index) według Hunter’a i Gastona (16). Wykonano analizę powtarzalności (R) według uprzednio opisanej procedury(13, 14).

W pierwszym etapie pracy wstępnie scharakteryzowano szczepy M. kansasii metodą PRA-hsp65 (tab. 1). Według bazy danych PRASITE 39 szczepów zostało zaklasyfikowanych jako M. kansasii typu I, który uznany jest przez wielu autorów jako najczęściej izolowany od ludzi, rzadziej ze źródeł środowiskowych (3, 6, 18). Jeden szczep (K20) zaklasyfikowany został jako M. avium typ I, natomiast 3 szczepy (K7, K27, K45), określone we wczesnych etapach identyfikacji gatunkowej jako M. kansasii, według profilu PRA-hsp65 określone zostały jako M. fortuitum typu I. Taki wynik może sugerować, że są to nieopisane wcześniej nowe typy M. kansasii, ponieważ już wcześniej wykazano identyczne lub bardzo podobne profile PRA-hsp65 dla różnych gatunków (12). Pięć szczepów (K12, K32, K33, K39, K40) zostało określonych jako niemożliwe do zidentyfikowania według PRA-hsp65. Podobne problemy były, opisywane w badaniach innych ośrodków. Świadczyć to może o małej elastyczności metody PRA-hsp65. Ponadto, często opisywane są nowe warianty PRA-hsp65 dla różnych gatunków z rodzaju Mycobacterium (11, 12), dlatego też konieczne wydaje się sukcesywne uaktualnianie bazy danych profili PRA-hsp65 lub też prowadzenie wewnętrznej bazy danych takich profili przez każde laboratorium zajmujące się oznaczeniami tego typu.

Następnie wykonano testy TRS-PCR dla całej kolekcji szczepów M. kansasii z użyciem starterów posiadających bogate w pary G/C motywy TRS: (N)₆(CGG)₄, (N)₆(CCG)₄, (N)₆(CAC)₄, (N)₆(CAG)₄, (N)₆(GTC)₄, (N)₆(GTG)₄, (N)₆(CTG)₄, (N)₆(GAC)₄, (N)₆(TCC)₄, (N)₆(AGG)₄. Dla każdej z analiz określono powtarzalność uzyskiwanych wyników. Stwierdzono, że największą powtarzalność uzyskano dla analiz TRS-PCR z wykorzystaniem startera zawierającego motyw CAG (R = 93,61%) (tab. 2). Jednak biorąc pod uwagę siłę różnicowania (16) najbardziej przydatne okazały się startery (N)₆(CGG)₄ (DI = 0,943) i (N)₆(CCG)₄ (DI = 0,939) (ryc. 1A i B), a powtarzalność uzyskiwania wzorów prążkowych była na zbliżonym poziomie i wynosiła odpowiednio 92,61 i 90,82% (tab. 2). Takie wyniki są zgodne z faktem wysokiej zawartości par G/C i nadreprezentacji motywów CGG w genomach prątków (22), prawdopodobnie również w przypadku M. kansasii, którego sekwencja genomowa nie została jeszcze opisana. W przypadku pozostałych starterów otrzymano wzory prążkowe dla każdego szczepu, jednakże obliczone wartości indeksu Hunter’a – Gaston’a (16) wskazywały na wysokie podobieństwo szczepów M. kansasii między sobą i wynosiły poniżej 0,9.

Warto zwrócić uwagę na to, że wzory prążkowe uzyskane za pomocą testu CCG-PCR grupują się w trzy jednorodne klastry, podczas gdy analiza podobieństwa profili uzyskanych poprzez test CGG-PCR wykazuje duże zróżnicowanie genetyczne szczepów oznaczonych jako K002, K013, K019, K043, K048. Szczepy te, określone według PRA-hsp65 jako M. kansasii typu I, różnią się nie tylko od większości szczepów z kolekcji, jak i między sobą (ryc. 1A). Można więc wnioskować, że metoda wykorzystująca starter zawierający motyw CGG w porównaniu do metody CCG-PCR pozwala na większe zróżnicowanie w obrębie kolekcji szczepów M. kansasii. Ponadto, szczepy określone jako nietypowalne według PRA-hsp65 oraz szczep określony jako M. avium typu I, grupowały się razem ze szczepami określonymi jako M. kansasii typu I zarówno w testach CGG-PCR i CCG-PCR, jak i w pozostałych analizach TRS-PCR. Sugeruje to przynależność tych szczepów do gatunku M. kansasii. Dodatkowo, szczepy oznaczone jako K007, K027, K045, które według profilu PRA-hsp65 zostały określone jako M. fortuitum typu I stanowią odrębną grupę, z podobieństwem do szczepów M. kansasii poniżej 50%, w przypadku większości analiz TRS-PCR (z wyjątkiem GAC-PCR, podobieństwo 63% oraz TCC- i AGG-PCR, gdzie nie uzyskano produktów amplifikacji). Zjawisko to jest szczególnie widoczne w przypadku analiz podobieństwa wykonanych na podstawie testów CGG-PCR i CCG-PCR (ryc. 1A i B). Ponadto szczepy K007, K027, K045 wykazywały inny charakter wzrostu na podłożu Lowensteina – Jensena od pozostałych szczepów z analizowanej kolekcji. Z powyższych względów można było wysnuć przypuszczenie, że nie należą one do gatunku M. kansasii i zostały błędnie określone gatunkowo we wczesnych etapach identyfikacji lub też uległy one zakażeniu podczas kolejnych pasażowań. Powtórne analizy z wykorzystaniem testu GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Nehren, Germany) wykazały przynależność tych szczepów do M. fortuitum. Zastosowanie testów CGG-PCR i CCG-PCR pozwoliło potwierdzić odrębność szczepów M. fortuitum, a co za tym idzie pozwoliło na wykrycie takich błędnie sklasyfikowanych szczepów, co może stanowić dużą zaletę metody TRS-PCR.

Dodatkowo, to zjawisko sugeruje, że test TRS-PCR może być testem dobrze grupującym szczepy gatunkowo. W związku z tym w dalszej części pracy wykonaliśmy analizy przydatności testu CGG-PCR, najefektywniejszego w różnicowaniu kolekcji szczepów M. kansasii, do różnicowania wybranych gatunków z rodzaju Mycobacterium, takich jak M. avium, M. gordonae, M. kansasii, M. xenopi, M. tuberculosis i M. intracellulare. Poziom podobieństwa wzorów prążkowych uzyskanych dla analizowanych gatunków nie przekraczał 50% (ryc. 2). Zatem test ten może znaleźć zastosowanie w analizach identyfikacji gatunkowej prątków, szczególnie w przypadku odróżniania mykobakteriozy od gruźlicy.

Reasumując, można stwierdzić, że test TRS-PCR umożliwia różnicowanie M. kansasii. Pomimo że analizy z wykorzystaniem starterów zawierających motywy CGG i CCG wykazały wysoką siłę różnicowania i profile prążkowe różniły się między sobą, to różnice te nie są na tyle wyraźne, żeby test stosowany samodzielnie był definitywnie rozstrzygający w dochodzeniach epidemiologicznych, które wymagałyby uzupełnienia dodatkowymi metodami.

1. Test molekularny TRS-PCR jest przydatny do różnicowania podtypów Mycobacterium kansasii i umożliwia identyfikację wybranych gatunków prątków atypowych.

2. Ze względu na powszechność występowania prątków atypowych w Polsce istnieje konieczność poszukiwania testów odróżniających M. tuberculosis complex od prątków niegruźliczych NTB.