Pierwotne włóknienie szpiku (PMF) jest rzadkim nowotworem mieloproliferacyjnym charakteryzującym się pancytopenią, leukoerytroblastozą w krwi obwodowej, włóknieniem szpiku oraz pozaszpikową hematopoezą, której wynikiem jest powiększenie śledziony i wątroby (1). Nowe spojrzenie na etiopatogenezę włóknienia szpiku (MF) związane jest z odkryciem w 2005 roku mutacji JAK2V617F, która odpowiedzialna jest za nadwrażliwość komórek na cytokiny, niepohamowane pobudzenie drogi sygnałowej JAK2-STAT i występuje u około 65% pacjentów z PMF (2, 3). Dotychczas opublikowane wyniki analiz nie pozwalają na jednoznaczne określenie różnic w obrazie klinicznym pomiędzy chorymi MF JAK2(+) i JAK2(-).

Analizie prospektywno-retrospektywnej poddano 77 pacjentów z rozpoznanym włóknieniem szpiku pierwotnym (PMF) oraz poprzedzonym nadkrwistością prawdziwą (post-PV MF) lub nadpłytkowością samoistną (post-ET MF), leczonych w Klinice Hematologii i Transplantacji Szpiku Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach w latach 2006-2010. Do badania włączono pacjentów z PMF zgodnie z kryteriami diagnostycznymi WHO z 2008 roku oraz z post-PV/ET MF zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Grupy Roboczej do Badania i Leczenia Włóknienia Szpiku (IWG-MRT) (4, 5). Aktualną analizą objęto 41 kobiet i 36 mężczyzn w medianie wieku 61 lat (zakres 19-81 lat). Szczegółową charakterystykę chorych przedstawiono w tabeli 1.

Oznaczenie mutacji JAK2V617F wykonano z DNA wyizolowanego z granulocytów krwi obwodowej przy zastosowaniu DNA Isolation Kit (High Pure PCR, Roche, Niemcy) z wykorzystaniem półilościowej, polimerazowej reakcji łańcuchowej (RQ-PCR), opartej na dyskryminacji allelicznej. Wykazanie > 2% ilości zmutowanych alleli uznawano za wynik pozytywny. Homozygotyczność ustalono przy obecności zmutowanych alleli powyżej 50%. Badanie wykonano przy użyciu zestawu MutaScreen^TM firmy Ipsogen (Marsylia, Francja).

Ponieważ rozkład większości zmiennych różnił się istotnie od rozkładu normalnego (test Kołmogorowa-Smirnowa, p < 0,05), do ich opisu stosowano medianę (zakres), a do weryfikacji hipotez – testy nieparametryczne. W przypadku zmiennych numerycznych, różnice pomiędzy podgrupami analizowano z zastosowaniem testu U Manna-Whitneya. Prawdopodobieństwo przeżycia szacowano metodą Kaplana-Meiera (Kaplan-Meier Stat Med). Zależności pomiędzy dwiema zmiennymi numerycznymi badano z użyciem testu korelacji rang Spearmana. Różnice i zależności, dla których wartość p wyniosła < 0,05 uznawano za znamienne statystycznie (6, 7).

Spośród 77 pacjentów poddanych analizie, u 42 (54%) rozpoznano samoistne włóknienie szpiku, u 16 (46%) włóknienie poprzedzone nadkrwistością prawdziwą i u 19 (54%) włóknienie poprzedzone nadpłytkowością samoistną. Mutacja punktowa JAK2V617F była obecna u 42 pacjentów (55%), z tego u chorych z PMF (n = 42) występowała w 50% przypadków (n = 21), u chorych z post-PV MF (n = 16) w 88% (n = 14), podczas gdy w grupie post-ET (n = 19) tylko u 37% chorych (n = 7). U 18 chorych (43%) liczba zmutowanych alleli wynosiła < 50%, natomiast u pozostałych 24 (57%) ≥ 50%. Mediana liczby zmutowanych alleli wynosiła 22 (2-96).

Nie wykazano znamiennych różnic badanych parametrów pomiędzy pacjentami z mutacją JAK2 i bez tej mutacji, z wyjątkiem wyższej komórkowości szpiku w pierwszej grupie chorych: mediana 80% (zakres 20-100) versus 70% (zakres 20-100); p = 0,03. Mutacja JAK2 występowała z taką samą częstością u chorych z PMF (n = 21) i post-PV/ET MF (n = 21). Nie wykazano korelacji pomiędzy obecnością mutacji JAK2 a płcią, wiekiem, wielkością wątroby, śledziony, stężeniem hemoglobiny, liczbą leukocytów, krwinek czerwonych i płytek krwi, liczbą mieloblastów we krwi obwodowej i odsetkiem blastów w szpiku, aktywnością LDH, stopniem i fazą włóknienia szpiku oraz zakrzepicą. Mediana czasu obserwacji dla chorych bez mutacji JAK2 wynosiła 36,4 miesiąca (zakres 2,5-142,1), dla heterozygot – 17,3 miesiąca (zakres 3,6-206,4), a dla homozygot – 16,4 miesiąca (zakres 4,1-47,9).

U 24 chorych wykazano liczbę zmutowanych alleli JAK2 ≥ 50%, podczas gdy u 18 pacjentów < 50%. U chorych z PMF znamiennie częściej występowała heterozygotyczność (13 vs 8 chorych), podczas gdy homozygoty częściej wykrywano u pacjentów z post-PV/ET MF (16 vs 5 pacjentów); p = 0,01. Wykazano także, że homozygotyczność JAK2 znamiennie częściej występowała u kobiet, charakteryzowała się wyższą liczbą leukocytów w momencie diagnozy oraz tendencją do wyższego stężenia hemoglobiny.

W przedstawionej pracy dokonano analizy dużej grupy chorych z włóknieniem szpiku, biorąc pod uwagę rzadkie występowanie tej jednostki chorobowej. Wykorzystując metody biologii molekularnej oszacowano częstość występowania mutacji JAK2V617F w badanej grupie, jak również dokonano analiz porównawczych populacji z i bez obecności mutacji JAK2. Analizie poddano grupę 77 chorych (41 kobiet i 36 mężczyzn, w medianie wieku 61 lat) z pierwotnym włóknieniem szpiku (n = 42) i włóknieniem poprzedzonym czerwienicą prawdziwą (n = 16) lub nadpłytkowością samoistną (n = 19). Mediana czasu obserwacji od momentu rozpoznania wynosiła 22,3 miesiąca (zakres 2,5-206 miesięcy). Szesnastu chorych (21%) zmarło w trakcie obserwacji. Najczęstszą przyczyną śmierci były powikłania wynikające z postępu choroby prowadzące do niewydolności szpiku, powikłania infekcyjne czy też progresja do ostrej białaczki szpikowej.

Częstość występowania mutacji JAK2V617F w populacji chorych z włóknieniem szpiku szacuje się na 50-60% (3), a jej znaczenie kliniczne w tej grupie pacjentów jest przedmiotem wielu aktualnie prowadzonych analiz. W prezentowanym badaniu mutacja JAK2V617F została wykryta u 42 (55%) spośród 77 zbadanych chorych z włóknieniem szpiku (heterozygotyczność występowała u 43%, a homozygotyczność u 57% pacjentów). U 16 chorych z post-PV MF (46%) mutacja JAK2 występowała w 88% przypadków (n = 14), podczas gdy wśród 19 (54%) chorych z post-ET MF tylko u 37% (n = 7). Nie wykazano różnicy w częstości występowania mutacji JAK2 pomiędzy populacją chorych z PMF, a post-PV/ET MF. Homozygotyczność wykrywano znacząco częściej u pacjentów z post-PV/ET MF, podczas gdy heterozygotyczność w grupie PMF. W dużej analizie obejmującej 157 chorych z włóknieniem szpiku, częstość mutacji JAK2 wynosiła 51%, a homozygotyczność częściej wykrywano u chorych z post-PV MF (66%). Poddając analizie tylko chorych z post-PV MF, częstość mutacji JAK2 może sięgać 90% i jest porównywalna z wynikami uzyskanymi dla chorych z PV (2, 8). Podobny odsetek ilości zmutowanych alleli JAK2 wynoszący 88% u chorych z post-PV MF, z czego 86% przypadków to homozygoty, uzyskano także w grupie pacjentów analizowanych w niniejszej pracy. U pacjentów z post-ET MF częstość wykrywania mutacji JAK2 również jest porównywalna do chorych z ET (2, 9). Dane dotyczące korelacji pomiędzy obecnością mutacji JAK2, a obrazem klinicznym są często sprzeczne, co może wynikać z niewielkiej populacji badanych chorych. Szczegółowa analiza chorych z PMF przeprowadzona przez Tefferi i wsp. (8) (n = 117) wykazała istotnie statystyczną zależność pomiędzy obecnością JAK2V617F, a starszym wiekiem w momencie rozpoznania, wywiadem zakrzepowym i świądem. W badaniu Campbell i wsp. (10) stwierdzono natomiast, że pacjenci JAK2(+) mieli wyższą liczbę krwinek białych i granulocytów oraz mniejsze zapotrzebowanie na preparaty krwiopochodne w porównaniu z chorymi JAK2(-). Do innych wniosków doszła grupa badaczy z Mayo Clinic w Rochester , która po zbadaniu 199 chorych z PMF wykazała, że obecność mutacji JAK2 wiązała się ze starszym wiekiem w momencie rozpoznania choroby, wyższym odsetkiem chorych z liczbą płytek > 100 x 10⁹/L i niższym odsetkiem blastów > 3% we krwi obwodowej (11). W obecnym opracowaniu wykazano różnicę w wyższej komórkowości szpiku u chorych JAK2(+) w stosunku do JAK2(-) oraz stwierdzono, że homozygotyczność JAK2 częściej jest obserwowana u kobiet, z wyższą liczbą białych krwinek w momencie rozpoznania i wyższym stężeniem hemoglobiny. Związek mutacji JAK2 z płcią żeńską został wykazany wcześniej przez Levine i wsp. (9) u chorych z PV, natomiast nie potwierdzono tego spostrzeżenia u pacjentów z PMF i post-PV MF (8). W niniejszej pracy wykazano związek pomiędzy homozygotycznością JAK2, a płcią żeńską (p = 0,05). W innej analizie, która objęła 174 chorych z PMF ustalono, że chorzy z obecną mutacją V617F w porównaniu do pacjentów bez tej nieprawidłowości wykazywali wyższe stężenie hemoglobiny i częstsze występowanie świądu. Dodatkowo homozygotyczność JAK2 w porównaniu do heterozygotyczności wiązała się z niższą liczbą płytek krwi, wyższą liczbą leukocytów, znaczną wielkością śledziony i częstszą koniecznością zastosowania leczenia cytoredukcyjnego (12). Podobne tendencje obserwowano w aktualnej pracy w odniesieniu do liczby leukocytów i stężenia hemoglobiny.

Jak dotąd jedynym badaniem, które potwierdziło związek pomiędzy obecnością mutacji JAK2, a krótszym przeżyciem chorych z PMF są wyniki przedstawione przez Campbell i wsp. (10) w oparciu o 152 chorych. Autorzy wykazali, że pacjenci JAK2(+) mieli ponad 3-krotnie większe ryzyko zgonu w porównaniu z grupą JAK2(-). W kolejnych badaniach wykazano znaczące statystycznie krótsze całkowite przeżycie i przeżycie bez transformacji do białaczki tylko w populacji heterozygot JAK2, podczas gdy przebieg choroby był podobny w populacjach homozygotycznej i przy braku mutacji (11, 12). Wyniki te pozostają jednak w sprzeczności z danymi grupy włoskiej GIMEMA, gdzie liczba zmutowanych alleli nie miała wpływu na przeżycie chorych, a jedynie homozygotyczność JAK2 wiązała się z bardziej agresywnym przebiegiem klinicznym i wyższym ryzykiem wystąpienia kryzy. Przyczyna tych rozbieżności jest trudna do wyjaśnienia i może być związana z heterogennością chorych włączonych do analizy (73). W aktualnym opracowaniu mediana czasu obserwacji dla chorych bez mutacji JAK2 wynosiła 36,4 miesiąca (zakres 2,5-142,1), dla heterozygot – 17,3 miesiąca (zakres 3,6-206,4), a dla homozygot – 16,4 miesiąca (zakres 4,1-47,9).

Oddzielnego omówienia wymaga populacja chorych z włóknieniem szpiku poprzedzonym nadkrwistością prawdziwą lub nadpłytkowością samoistną. Przedstawione dotychczas wyniki badań nie wykazały wpływu zarówno braku lub obecności mutacji JAK2, jak i liczby zmutowanych alleli na obraz kliniczny oraz rokowanie (14, 15). Spostrzeżenia autorów dotyczące roli mutacji JAK2 w rozwoju MF potwierdzono w ostatnio opublikowanej prospektywnej analizie obejmującej 338 pacjentów. Wykazano, że homozygotyczność JAK2V617F jest istotnym czynnikiem ryzyka rozwoju włóknienia szpiku u chorych z PV (16). W aktualnej pracy analizowano łącznie 35 chorych zarówno z PV i ET. Nie wykazano różnicy w prawdopodobieństwie wystąpienia włóknienia szpiku pomiędzy chorymi JAK2+ i JAK2- (23 vs 14% po 15 latach).

W przedstawionej pracy potwierdzono obecność mutacji JAK2V617F u 50-60% chorych z włóknieniem szpiku. Mutacja ta częściej występowała u chorych z włóknieniem szpiku poprzedzonym nadkrwistością prawdziwą. Nie wykazano korelacji pomiędzy statusem mutacji JAK2 a całkowitym przeżyciem.