Zakażenia grzybicze dotyczą obecnie ok. 40% ludności świata. Najczęstszą ich lokalizacją pozostaje skóra i jej wytwory (1). Powierzchowne zakażenia grzybicze ograniczają się do zewnętrznych warstw skóry, paznokci, włosów oraz błon śluzowych. Wśród grzybiczych zakażeń skóry wyróżnić można: dermatofitozy wywołane przez dermatofity, drożdżyce wywołane przez grzyby drożdżopodobne oraz pleśnice, których przyczyną są grzyby pleśniowe. W większości przypadków grzybice powierzchowne nie zagrażają życiu pacjentów, jednak w niektórych przypadkach mogą być bardzo uciążliwe, a także przenosić się z człowieka na człowieka (dermatofity antropofilne). Dla osób z obniżoną odpornością mogą stanowić wrota dla grzybic układowych wywoływanych przez grzyby pleśniowe.

Powstawaniu i szerzeniu się grzybic powierzchownych sprzyja postęp cywilizacji, w tym stosowanie antybiotyków, kortykosteroidów i leków immunosupresyjnych (2, 3). Zamieszkiwanie w skupiskach (internaty, hotele, sanatoria, koszary) sprzyja infekcjom skóry i jej wytworów ze względu na korzystanie ze wspólnych urządzeń sanitarnych. Pośredni kontakt z zarodnikami grzybów znajdującymi się na dywanach, matach kąpielowych i podestach pod prysznicami ułatwia przenoszenie się grzybów z jednej osoby na drugą. Noszenie nieprzewiewnych ubiorów i obuwia wykonanego z materiałów syntetycznych stwarza odpowiedni mikroklimat, który ułatwia ich rozwój (4, 5).

Wzrost liczby i zasięgu zakażeń grzybiczych jest spowodowany rosnącą populacją osób podatnych na choroby. Czynnikami usposabiającymi są warunki miejscowe na skórze, w tym najważniejsze znaczenie ma wilgotność i skład lipidów powierzchownych. Jednym z głównych czynników ogólnoustrojowych jest stan immunologiczny chorego. Obniżenie odporności gospodarza sprzyja rozwojowi infekcji skóry i jej wytworów.

Pomimo ciągłego postępu w rozpoznawaniu i leczeniu powierzchownych zakażeń grzybiczych stanowią one nadal poważny problem terapeutyczny i społeczny. Z zagadnieniami tymi stykają się lekarze dermatolodzy, lekarze pierwszego kontaktu i specjaliści innych dziedzin medycyny. Z uwagi na powszechność ich występowania i możliwość przeniesienia na inne osoby stanowią również problem epidemiczny (2).

Celem pracy była analiza wyników posiewów materiałów klinicznych pochodzących ze zmian na skórze od 2024 pacjentów badanych w Zakładzie Mikrobiologii Pracowni Mikologii IGiCHP w latach 2000-2010.

Analizie poddano wyniki badań mikologicznych pacjentów skierowanych do zakładu Mikrobiologii IGiCHP w Warszawie w latach 2000-2010. Badaniem objęto 2024 pacjentów z podejrzeniem o grzybicę, od których pobrano 2863 materiały. Byli oni kierowani przez lekarzy dermatologów z SPZOP dla Szkół Wyższych Przychodni Specjalistycznej „Palma” lub innych specjalistów z województwa mazowieckiego. W badanej grupie znajdowali się również pacjenci IGiCHP oraz przypadkowe osoby kierowane w celu wykluczenia bądź potwierdzenia zakażenia grzybiczego.

Przed przystąpieniem do pobrania materiału przeprowadzano wywiad z pacjentem, który zawierał pytania o:

– podejmowanie prób leczenia tzw. metodami domowymi i stosowanie preparatów dostępnych w aptekach,

– czas i okoliczności pojawienia się zmian klinicznych,

– kontakt ze zwierzętami,

– zawód pacjenta,

– choroby zasadnicze,

– podróże (uprzednie przebywanie za granicą kraju).

Jeżeli zmiany były poddawane jakiemukolwiek leczeniu zalecano kilkudniową przerwę (1-10 dni) przed pobraniem materiału.

Materiał do badań pobierano z miejsc chorobowo zmienionych: paznokci, stóp, dłoni, skóry gładkiej i skóry owłosionej głowy za pomocą jałowych narzędzi (nożyczki, skalpele, cążki). Materiał z paznokcia pobierano z łamliwej, kruchej odbarwionej części. Zmiany złuszczające się zeskrobywano z aktywnego obrzeża wykwitu.

Pobrany materiał umieszczano w kwadratowym arkuszu czarnego papieru (ok. 10 cm x 10 cm) oddzielnym dla każdego badanego ogniska chorobowego. Czarny papier pozwolił na łatwe odnalezienie drobinek materiału na kwadracie oraz umożliwił dogodny sposób przechowywania przez długi okres (12 miesięcy i dłużej). W przypadku podejrzenia kandydozy wałów okołopaznokciowych z obecnością ropy używano wymazówki zwilżonej tuż przed pobraniem jałową wodą lub 0,9% roztworem chlorku sodowego. Z pobranego materiału wykonywano preparat bezpośredni, używając dwumetylosulfotlenku (DMSO), który miał na celu częściowe rozpuszczenie keratyny znajdującej się w tkankach i uwidocznienie grzybów.

Poszukując elementów grzybów przygotowane preparaty oglądano w mikroskopie świetlnym po upływie kilku minut od dodania DMSO, używając powiększenia 100x a następnie 200x i 400x.

Należy wziąć pod uwagę, że w preparatach rozjaśnionych DMSO mogą występować także artefakty imitujące strzępki grzybni. Są to najczęściej rozpuszczone komórki naskórka tworzące rozgałęzione nici (tzw. grzyb mozaikowy). Preparat bezpośredni z materiału klinicznego jest badaniem pomocniczym i umożliwia wstępne rozróżnienie dermatofitów, grzybów drożdżopodobnych i pleśni. Na jego podstawie jednak nie jest możliwe określenie gatunku patogenu (7).

W drugiej części badania mikologicznego wykonywano posiew. Bez względu na obecność lub brak elementów grzyba w preparacie bezpośrednim materiał posiewano na dwa podłoża Sabourauda, jedno zawierające substancje hamujące wzrost bakterii: chloramfenikol, drugie z dodatkiem cykloheksamidu (actidion) hamujące wzrost grzybów pleśniowych. W przypadku podejrzenia zakażenia grzybem lipofilnym Malassezia furfur materiał posiewano na podłoże Sabourauda z 1% dodatkiem jałowej oliwy z oliwek. Oliwę nanoszono i równomiernie rozprowadzano po podłożu wymazówką. Hodowle w grzybicach powierzchownych inkubowano w temperaturze 27°C. Czas prowadzenia hodowli uzależniony był od rodzaju grzyba. Dla grzybów drożdżopodobnych wynosił on 48-72 godz. w przypadku Pityriasis versicolor hodowle inkubowano w temp. 27-30°C przez ok. 1 tydzień. Większość grzybów pleśniowych wymagała od 5-7 dni inkubacji. Czas wzrostu dermatofitów wynosił od 1-4 tygodni (6) (ryc. 1).

W ocenie morfologii dermatofitów brano pod uwagę: zabarwienie powierzchni i spodniej części kolonii, kształt, wzniesienie nad powierzchnię podłoża, konsystencję, brzeg, zdolność do produkcji barwników, zapach. Konsystencja kolonii była od mączystych i gipsowatych do puszystych. Następnie dokonywano przesiewu uzyskanych kolonii na podłoże Sabourauda. Po uzyskaniu hodowli (od 7 do 20 dni w temp. 27°C) wykonano preparaty używając laktofenolu. Poszukiwano charakterystycznych owocowań konidialnych, makro- i mikrokonidii oraz formacji w postaci: strzępek rakietowych, spirali, tworów węzłowych, charakterystycznych dla poszczególnych gatunków dermatofitów (ryc. 2, 3).

Do identyfikacji dermatofitów, podobnie jak w przypadku grzybów pleśniowych używano odpowiednich monografii (8, 11). Pomocne były także dane dotyczące lokalizacji zakażenia i jego źródła (7).

W przypadku grzybów pleśniowych zwracano uwagę na morfologię kolonii i prowadzono ocenę mikroskopową preparatów. Poszukiwano owocowań powstałych w wyniku rozmnażania bezpłciowego i płciowego.

Diagnostykę grzybów drożdżopodobnych prowadzono w oparciu o ocenę makroskopową hodowli. Następnie wykonano preparat bezpośredni w jałowej soli fizjologicznej, oceniając kształt i wielkość blastospor. Grzyby drożdżopodobne identyfikowano w oparciu o morfologię kolonii oraz cechy biochemiczne używając podłoża chromogennego Chrom Agar Candida, przy pomocy którego wykrywano aktywność enzymatyczną grzybów. Następny etap identyfikacji to test biochemiczny ID 32C do odczytu komputerowego lub wizualnego. Dla grzybów drożdżopodobnych izolowanych licznie ze zmian klinicznych, wykonywano ocenę wrażliwości na leki przeciwgrzybiczne.

Uzupełnienie diagnostyki stanowiło oglądanie chorobowo zmienionych miejsc w świetle ultrafioletowym lampy Wooda, w celu wykazania charakterystycznej fluorescencji ognisk. Wykorzystanie lampy Wooda jest przydatne w różnicowaniu erythrasmy (schorzenie o etiologii bakteryjnej – fluorescencja czerwono koralowa) z grzybicą pachwin lub zakażeniem przestrzeni m/palcowych (9, 10).

Z 2863 materiałów pobranych od 2024 chorych wyniki dodatnie uzyskano w 1027 przypadkach (35,9 %). Wśród 1027 szczepów grzybów 783 zidentyfikowano jako dermatofity (76,2%), 196 grzyby drożdżopodobne (19,1%), 48 grzyby pleśniowe (4,7%), zakażenia mieszane stanowiły 39 przypadków (3,8%) (ryc. 4).

W grupie 783 przypadków infekcji dermatofitami najczęściej wykrywanym patogenem był Trichophyton mentagrophytes 710 przypadków (90,7%). Drugim, co do częstości występowania grzybem dermatofitowym był Trichophyton mentagrophytes v.gypseum (31 przypadków 3,9%). Kolejne miejsca zajmowały Trichophyton rubrum i Epidermophyton floccosum z częstością odpowiednio: 18 (2,3%) i 11 (1,4%). Trichophyton tonsurans i Microsporum canis stanowiły 5 przypadków zakażeń (0,6%). Odnotowano także pojedyncze zakażenia patogenami: Trichophyton mentagrophytes var.interdigitale (0,25%), Trichophyton ajelloi (0,1%). Najczęstszą lokalizacją zakażenia były paznokcie stóp (56,1%). Porównywalnie często obserwowano zakażenia skóry stóp i przestrzeni m/palcowych stóp (odpowiednio (18,0 i 17,9%). Umiejscowienie zakażenia na skórze gładkiej miało miejsce w 29 przypadkach (3,7%). Rzadziej stwierdzano infekcje paznokci rąk (2,2%) i dłoni (2,0%). Wykryto pojedyncze zakażenie owłosionej skóry głowy (0,1%) (tab. 1).

Obserwowano zależność pomiędzy poszczególnymi gatunkami dermatofitów a zakażeniem określonych okolic ciała. Trichophyton mentagrophytes był najczęstszym patogenem paznokci stóp (410 przypadków) a Microsporum canis stanowił 5 przypadków infekcji skóry gładkiej. Zakażenie Epidermophyton floccosum zaobserwowano na skórze gładkiej (3 przypadki) i w przestrzeniach m/placowych stóp (5 przypadków).

Gatunki grzybów drożdżopodobnych biorące udział w zakażeniach powierzchownych przedstawiono w tabeli 2. W grupie tej najczęściej izolowano: Candida parapsilosis (43,4%), Candida albicans (32,1%), Candida tropicalis (5,1%), Candida famata (4,1%), Candida guilliermondii (3,1%), Rhodotorula spp. (2,6%), Trichosporon mucoides (2,0%), Malassezia spp. (2,0%). Odnotowano pojedyncze zakażenia Trichosporon asahii i Trichosporon cutaneum (0,6%). Najczęstszą lokalizacją zmian były paznokcie rąk w 121 przypadkach (61,7%) następnie zakażenia paznokci stóp (24,0%) i przestrzeni m/palowych stóp (8,2%). Najrzadziej stwierdzono infekcje skóry stóp (3,6%) skóry gładkiej (2,0%) oraz dłoni (0,6%).

Candida parapsilosis izolowano z paznokci rąk (24,5%), paznokci stóp (13,8%), przestrzeni m/palcowych stóp (4,1%) i ze skóry stóp (1%). Candida albicans wykrywano głównie w paznokciach rąk (28,1%), sporadycznie w przestrzeniach m/palcowych stóp i paznokciach stóp (2%). Candida tropicalis znalazła się na trzecim miejscu co do lokalizacji w paznokciach rąk (4,1%).

Grzyby pleśniowe stanowiły 4,7% wszystkich zakażeń. Izolowano je głównie z paznokci stóp: Acremonium spp. (31,2%), Scopulariopsis brevicaulis (20,8%), Fusarium spp. i Aspergillus spp. (10,4%) (tab. 3). Umiejscowienie zakażenia w paznokciach rąk zaobserwowano w 5 przypadkach: Fusarium spp. – 1 przypadek (2,1%) i Aspergillus spp. – 4 przypadki (8,3%). Pojedyncze zakażenie przez Acremonium spp. (2,1%) odnotowano w przestrzeniach m/palcowych stóp.

Mieszane zakażenia grzybicze stanowiły 3,8% posiewów (tab. 4). Wystąpiły one w 39 przypadkach. W 23 współwystępowały dermatofity i grzyby drożdżopodobne. Współistnienie dermatofitów i grzybów pleśniowych odnotowano w 14 przypadkach. Dwa przypadki dotyczyły obecności grzybów drożdżopodobnych i grzybów pleśniowych. Zakażenia mieszane, w przypadku których z jednego posiewu izolowano dermatofity i grzyby drożdżopodobne dotyczyły głównie paznokci stóp (11 przypadków), w drugiej kolejności w przestrzeniach m/palcowych stóp (7 przypadków). Pojedyncze lokalizacje miały miejsce na stopach, paznokciach dłoni i dłoniach. Współistnienie dermatofitów i grzybów pleśniowych zaobserwowano głównie na paznokciach stóp (13 przypadków). Jeden przypadek dotyczył lokalizacji w przestrzeniach m/palcowych. Grzyby drożdżopodobne i grzyby pleśniowe współwystępowały w 2 przypadkach (paznokcie stóp).

Spośród 2863 badań dodatnie wyniki badań mikologicznych (preparaty bezpośrednie potwierdzone hodowlą) uzyskano w 940 przypadkach (32,8 %) (tab. 5). W 87 przypadkach uzyskano potwierdzenie obecności grzybów w hodowli, bez potwierdzenia elementów grzybów w badaniu bezpośrednim. Zmiany chorobowe potwierdzone dodatnimi wynikami badań bezpośrednich, a ujemnymi wynikami hodowli uzyskano w 159 przypadkach.

Głównym kryterium rozpoznania grzybicy jest wyhodowanie grzyba od pacjenta, który ma być poddany leczeniu. Prawidłowo wykonane badanie mikologiczne jest podstawą rozpoznania zakażeń grzybiczych. W ocenianym materiale klinicznym najczęściej rozpoznawano grzybicę paznokci stóp (51,4%), następnie grzybicę przestrzeni m/palcowych stóp (15,3%), skóry stóp (14,4%) i paznokci rąk (13,9%). Przyczyną większości zakażeń był Trichophyton mentagrophytes. Stanowił on 69,1% dodatnich hodowli grzybiczych. Wyniki własne dotyczące dermatofitów pokrywają się z danymi opisanymi przez Aste i wsp. (12). Najczęściej izolowanym dermatofitem ze zmian w obrębie skóry stóp był T. mentagrophytes (51,5%), następnie T. rubrum (45,2%). Podobne wyniki przedstawili Ogasawara i wsp. (13). W przeprowadzonym przez nich badaniu głównym patogenem był Trichophyton mentagrophytes (41,0%), kolejno Trichophyton rubrum (33%). Nieco odmienne zdanie przedstawiają Szarmach i Nowicki. W badaniach przeprowadzonych na grupie 505 chorych najczęściej izolowanym dermatofitem był Trichophyton rubrum. Drugim, co do częstości występowania był Trichophyton mentagrophytes (14).

Grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida stanowiły 19,1% ogółu przypadków. W badanym materiale większość zakażeń powodowała Candida albicans. Dotyczyły one głównie paznokci rąk. Baran i wsp. (15) wykazali w latach 1974-1979 w makroregionie Dolnego Śląska podobne dane. Najczęstszą przyczyną zakażeń grzybiczych paznokci rąk była również Candida albicans. Dane te potwierdzili Szarmach i Nowicki (14). Wykazali oni niedermatofitowe zakażenie paznokci rąk przez Candida albicans.

Grzyby pleśniowe stanowiły 4,7% ogólnej liczby hodowli dodatnich. Izolowano najczęściej Scopulariopsis brevicaulis i Acremonium spp. W badanym materiale większość zakażeń dotyczyła paznokci stóp, a lokalizacja obejmowała w większości przypadków paznokieć palucha stopy. Dotyczyło to zazwyczaj osób starszych po mikrourazach płytki paznokciowej, spowodowanych niewygodnym obuwiem lub deformacją stopy (halluksy). Uszkodzone paznokcie są bardziej podatne na infekcje m.in. na wniknięcie grzybów. Zmiany chorobowe w wyniku których został upośledzony przepływ krwi przez naczynia obwodowe (cukrzyca, żylaki kończyn dolnych) stanowią sprzyjające warunki do rozwoju pleśnicy stóp, jak również innych zakażeń powierzchownych powodowanych przez grzyby (16). Mniejszą rolę w pleśnicy paznokci w obserwowanym materiale odgrywały m.in. Aspergillus spp. (5 przypadków), a także Penicillium spp., Cladosporium spp. Większy odsetek Aspergillus spp. i Alternaria spp. odnotowali w swoim materiale Laskownicka i wsp. (17). Wynosił on 12,4% w zmianach paznokciowych stóp oraz 10,4% w zmianach paznokciowych rąk. Autorzy nie analizowali szczegółowo ich znaczenia patogennego. W wielu przypadkach znaczenie patogenne pleśniowców może być dyskusyjne (18).

W naszym materiale omówienia wymagają także mieszane zakażenia grzybicze niedermatofitami. Na ogólną liczbę 39 hodowli mieszanych 23 dotyczyło współistnienia dermatofitów i grzybów drożdżopodobnych. Podobne wyniki przedstawili Sowiński i wsp. (19), analizując w latach 1977-1982 grzyby chorobotwórcze w paznokciach na dużym materiale chorych. Stwierdzili 20 przypadków infekcji mieszanej dotyczącej współistnienia dermatofitów i grzybów drożdżopodobnych. Z kolei Maleszka i wsp. (20) otrzymali w latach 1977-1994 łącznie 18% hodowli mieszanych. Najczęściej dermatofity izolowano łącznie z grzybami pleśniowymi. Nieco odmienne dane przedstawiają nasze badania o współwystępowaniu dermatofitów i grzybów drożdżopodobnych, jako najczęstszych. Korelacja między preparatem bezpośrednim z materiału a wynikiem posiewu w analizowanych przypadkach przedstawiała się następująco. Wśród 1027 wyizolowanych szczepów grzybów w 940 przypadkach wynik mikroskopowego badania z materiału został potwierdzony wynikiem hodowli (91,5%). W 87 przypadkach przy ujemnym preparacie bezpośrednim z materiału uzyskano grzyby w hodowli. Prawdopodobnie materiał mógł być pobrany niewłaściwie, bądź zbyt mała ilość materiału nie pozwoliła na wielokrotne wykonanie badania bezpośredniego. Większą cześć materiału uzyskanego od pacjenta przekazano do hodowli, która jest najbardziej wiarygodna metodą uzyskania grzybów chorobotwórczych. Wśród 2024 osób poddanych badaniu w 1836 przypadkach uzyskano negatywne wyniki hodowli. W tym w 159 przypadkach dodatni wynik preparatu bezpośredniego nie został potwierdzony hodowlą. Prawdopodobnie wskazywałoby to na możliwość stosowania przez pacjentów preparatów, dostępnych w aptekach przed badaniem. Utrudniają one znacznie wzrost grzybów chorobotwórczych, dając fałszywie ujemne wyniki hodowli. W opisie wyniku badania, zalecano powtórne badanie po uprzednim, właściwym przygotowaniu pacjenta. Zaobserwowano również przypadki powtórnego badania, podczas którego badanie bezpośrednie było dodatnie, a wynik kontrolnej hodowli ujemny. Świadczy to, że grzyb był martwy i niezdolny do wzrostu in vitro, mimo obecności w materiale. Może to wynikać z faktu, że stosowany przez pacjenta lek odłożył się w keratynie, osłabiając wzrost grzyba. W badaniach mikologicznych prowadzonych przez Maleszkę i Rzepecką z 80 klinicznie zmienionych płytek paznokciowych tylko w 17 przypadkach udało się uzyskać hodowlę grzybów (21). Pawłowicz i Adamski u 200 osób spośród 790 z dodatnimi badaniami bezpośrednimi nie uzyskali wzrostu grzybów w hodowlach (22). Maleszka tłumaczy niepowodzenia w uzyskaniu hodowli niedostatecznym rozdrobnieniem materiału, tj. posianiem całych fragmentów paznokci, co mogło uniemożliwić kontakt grzybów z podłożem i w efekcie powodować brak wzrostu, bądz posianiem materiału zawierającego obumarłe elementy grzybów (20, 21).

1. Dermatofity były najczęstszym czynnikiem etiologicznym grzybic. Wśród nich dominującym gatunkiem był Trichophyton mentagrophytes.

2. Najczęściej zmiany chorobowe dotyczyły paznokci stóp.

3. Badanie kliniczne i mikologiczne powinno być podstawą rozpoznania grzybicy skóry i jej wytworów.