Ostre zapalenie trzustki (ozt) wg koncepcji przyjętej przez wielu badaczy jest chorobą z samotrawienia charakteryzującą się proteolityczną destrukcją miąższu, martwicą ścian naczyń krwionośnych prowadzącą do krwotoków, martwicą tkanki tłuszczowej oraz odczynem zapalnym. Powszechnie przyjmuje się, że kluczowym mechanizmem w patogenezie ozt jest przedwczesna aktywacja trypsynogenu, która zapoczątkowuje sekwencję zdarzeń prowadzących do wewnątrzkomórkowej aktywacji enzymów trzustkowych. Fizjologicznie trawienne enzymy trzustkowe zawarte w ziarnistościach zymogenu są odseparowane od enzymów lizosomalnych „zamkniętych” w lizosomach. W warunkach prawidłowych niektóre z enzymów trawiennych, np. amylaza, lipaza, DNAaza, RNAaza są wydzielane przez komórki trzustkowe w formie aktywnej, ale inne, potencjalnie niebezpieczne, np. trypsyna, chymotrypsyna, fosfolipaza, elastaza, karboksypeptydaza są syntetyzowane jako nieaktywne proenzymy, których aktywacja zachodzi dopiero po ich przejściu do dwunastnicy, gdzie enterokinaza aktywuje trypsynogen do trypsyny, która z kolei katalizuje aktywację innych proenzymów.

Tak więc zasadniczym problemem stało się wyjaśnienie, jakie zmiany zachodzą w komórkach trzustkowych we wczesnych okresach ozt, które doprowadzają do wewnątrzkomórkowej aktywacji enzymów. Było to impulsem do przeprowadzenia wielu badań nie tylko biochemicznych i czynnościowych, ale również morfologicznych, w tym ultrastrukturalnych przy użyciu eksperymentalnych modeli ozt. Jedną z ważniejszych hipotez jest tzw. hipoteza kolokalizacji (co-localization hypothesis) (1). Punktem wyjścia do jej powstania były głównie badania ultrastrukturalne. Przy użyciu techniki freeze fracture i mikroskopii elektronowej wykazano, że najwcześniejsze zmiany ultrastrukturalne w doświadczalnym obrzękowym ceruleinowym ozt dotyczą błon ziarnistości zymogenu i błon plazmatycznych komórek pęcherzykowych trzustki (2). Stwierdzono, że blokada egzocytozy ziarnistości zymogenu, upośledzenie dojrzewania wakuoli zagęszczających (normalnie proces ten prowadzi do segregacji enzymów trawiennych i lizosomalnych) oraz zlewanie się ziarnistości zymogenu prowadziło do formowania dużych, ograniczonych błonami wakuoli wewnątrzcytoplazmatycznych, które we wszystkich stadiach swego rozwoju zawierały enzymy trawienne i lizosomalne (2, 3, 4, 5, 6, 7). Ta współlokalizacja jest istotna w rozwoju ozt ponieważ enzymy lizosomalne, takie jak np. katepsyna B są zdolne do aktywowania trypsynogenu i wyzwalania kaskady enzymów trzustkowych (8, 9). Badania ultrastrukturalne z immunolokalizacją wykazały, że aktywacja trypsynogenu ma miejsce w wakuolach cytoplazmatycznych, a powstała trypsyna jest uwalniana do cytosolu (10, 11). Rolę katepsyny B w wewnątrzkomórkowej aktywacji trypsynogenu potwierdziły ostatecznie badania Halangka i wsp. (12), którzy stwierdzili, że u myszy pozbawionych genu katepsyny ctsb gen (-) aktywność trypsyny w trzustce w indukowanym ceruleiną ozt była o ponad 80% niższa niż u zwierząt ctsb gen (+), a badania ultrastrukturalne wykazały mniejsze uszkodzenie komórek pęcherzykowych. Badania Van Acker i wsp. (13) potwierdziły, że aktywacja trypsynogenu oraz zwiększenie kruchości struktur subkomórkowych są zależne od aktywności katepsyny B. Nowe badania ultrastrukturalne połączone z immunobarwieniem w mikroskopie elektronowym wykazały uszkodzenie błon komórkowych komórek pęcherzykowych w ceruleinowym i taururocholanowym ozt co prowadziło do napływu wapnia oraz penetracji albumin i IgG do cytoplazmy (14).

Ostatnio Hashimoto i wsp. (15) zaproponowali teorię autofagii dla aktywacji trypsynogenu w ozt. Badacze ci wykonali niezwykle interesujące badania z użyciem mikroskopu elektronowego i oznaczania ekspresji microtubule-associated protein 1 light chain 3 w ozt nad rolą zjawiska autofagocytozy w aktywacji trypsynogenu w komórkach pęcherzykowych trzustki – przy pomocy tych technik wykazali, że cytoplazmatyczne wakuole powstające w komórkach pęcherzykowych w indukowanym cholecystokininą ozt mają charakter wakuoli autofagowych. W celu przeanalizowania roli makroautofagii w ozt użyli myszy pozbawionych genu autofagii (autophagy-related 5 gen) w komórkach pęcherzykowych trzustki. Okazało się, że u zwierząt tych nie rozwinęło się ozt, a tylko niewielki, ograniczony obrzęk, a aktywacja trypsynogenu była znacznie zredukowana. Wyniki te sugerują, że proces autofagocytozy zwiększa dewastację komórek pęcherzykowych przez aktywację trypsynogenu do trypsyny we wczesnych stadiach ozt. Również najnowsze badania potwierdzają kluczowe znaczenie autofagocytozy ozt (16). W naszych pracach w przebiegu ozt indukowanego ceruleiną (17, 18, 19) w większości komórek pęcherzykowych trzustki obserwowaliśmy liczne, różnej wielkości wakuole – niektóre z nich zawierały łatwe do identyfikacji organelle komórkowe, takie jak częściowo zdegradowane ziarnistości zymogenu, fragmenty szorstkiej sieci śródplazmatycznej, mitochondria, w innych obserwowaliśmy tylko amorficzną zawartość i/lub błoniaste struktury (ryc. 1). Podobne, aczkolwiek bardziej nasilone zmiany stwierdzaliśmy w martwiczo--krwotocznym taurocholanowym ozt (20, 21). Obraz ten odpowiada tzw. makroautofagii, którą definiuje się jako sekwestrację części cytoplazmy obejmującą nie tylko rozpuszczalne białka, ale także organelle komórkowe do tzw. autofagosomów. Przez połączenie się z lizosomami autofagosomy stają się autolizosomami zawierającymi enzymy hydrolityczne, które nie tylko degradują sekwestrowany materiał, ale również hydrolizują trypsynogen do trypsyny (katepsyna B) (15, 22, 23). W naszych badaniach aktywacja trypsynogenu była 3-4-krotnie wyższa u zwierząt z ozt niż w grupie kontrolnej (17, 18, 20).

Jungerman i wsp. (24) stwierdzili, posługując się badaniami ultrastrukturalnymi z użyciem p/ciał przeciw aktynie i beta-tubulinie, postępującą degradację tych białek strukturalnych w obrębie mikrotubul i mikrofilamentów – zdaniem tych badaczy jest to najwcześniejsza morfologiczna zmiana w ceruleinowym ozt, która może prowadzić do zaburzeń w segregacji, transporcie i wydalaniu enzymów trawiennych. Za zjawisko to mogą być m.in. odpowiedzialne wolne rodniki tlenowe, którym przypisuje się istotną rolę w inicjacji i rozwoju ozt (25, 26, 27, 28, 29). Zastosowanie w przebiegu doświadczalnego ozt antyoksydantów, np. tauryny (30), melatoniny (31) czy allopurinolu (32) w sposób istotny poprawiało stan organelli komórkowych w badaniu w mikroskopie elektronowym. Z przytoczonych przykładów wynika, że ocena ultrastrukturalna wniosła istotny wkład do potwierdzenia roli rodników tlenowych w patogenezie ozt.

Dzięki badaniom ultrastrukturalnym stwierdzono, że powstające w przebiegu stymulacji ceruleiną wakuole wewnątrzcytoplazmatyczne zlewają się z boczną bądź podstawną, zamiast szczytową, częścią błony plazmatycznej (ryc. 2), wydalając swoją zawartość do przestrzeni śródmiąższowej, co z kolei prowadzi do narastania obrzęku (2, 33, 34). W przestrzeni śródmiąższowej znajdowały się czasem fragmenty zniszczonych komórek pęcherzykowych z ziarnistościami zymogenu (ryc. 3). Tak więc uczynnione enzymy znajdujące się w tkance śródmiąższowej gruczołu, jak również obserwowane w mikroskopie elektronowym „wyrzucanie” ziarnistości zymogenu do tkanki śródmiąższowej mogą prowadzić do uwalniania czynników wazoaktywnych i zaburzeń w mikrokrążeniu trzustkowym, które jest uważane za istotny czynnik w patogenezie ozt (35, 36).

Badania ultrastrukturalne przyczyniły się w znacznym stopniu do powiązania zaburzeń w mikrokrążeniu trzustkowym a rozwojem ozt. Upośledzenie mikrokrążenia we wczesnych stadiach ozt może odgrywać istotną rolę w progresji zmian obrzękowych do zmian krwotocznych i/lub martwiczych. Takano i wsp. (33) stwierdzili, że połączenie ceruleinowego ozt ze stresem prowadziło do stwierdzanej ultrastrukturalnie destrukcji komórek śródbłonka oraz zakrzepicy we włośniczkach – głównie z tymi zmianami strukturalnymi w obrębie układu włośniczkowego autorzy wiązali przejście ozt obrzękowego w krwotoczne. Brackett i wsp. (37) zwrócili uwagę na obrzęk komórek śródbłonka z formowaniem elektronowo przeziernych, wpuklających się do światła naczyń bąbli (blebs), odcinkową dezintegrację naczyniowych błon podstawnych, jak również uszkodzenie mitochondriów zarówno w komórkach śródbłonka, jak i mięśni gładkich błony środkowej tętniczek w ozt indukowanym zamknięciem pętli dwunastnicy (the closed duodenal loop technique). Również nasze badania ultrastrukturalne wykazały zależność między nasileniem zmian zapalnych a stanem naczyń w trzustce. Zarówno w ceruleinowym, jak i martwiczo-krwotocznym ozt często stwierdzaliśmy znaczny obrzęk (ryc. 4), a czasem całkowitą destrukcję komórek śródbłonka, sporadyczne pękanie naczyń krwionośnych, a także obecność skupisk płytek krwi i granulocytów w świetle naczyń. Zmiany w układzie naczyniowym były zdecydowanie mniej wyrażone w obrzękowej postaci ozt.¹

Reasumując, można stwierdzić, że badanie techniką mikroskopii elektronowej zmian zachodzących na poziomie subkomórkowym w przebiegu ostrego zapalenia trzustki istotnie przyczyniło się do wyjaśniania patogenezy tego schorzenia. Szczególnie ważny, jeśli nie decydujący, wydaje się udział badań ultrastrukturalnych w wiodących hipotezach kolokalizacji i autofagii. Często zjawiska obserwowane w mikroskopie elektronowym w przebiegu ozt w komórkach pęcherzykowych trzustki inicjowały badania czynnościowe i biochemiczne zmierzające do wyjaśnienia skomplikowanych procesów zachodzących w trzustce w przebiegu zapalenia, a przez to przyczyniły się do poszukiwania jak najlepszych metod terapeutycznych.