Nowa Medycyna - Ocena aktywności izoenzymów A i B N-acetylo-β-D-heksozoaminidazy w tkankach raka jelita grubego

¹Zakład Medycyny Ratunkowej i Katastrof, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Jerzy Robert Ładny
²Zakład Radiologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Kierownik Zakładu: dr n. med. Elżbieta Gościk
³Klinika Psychiatrii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Kierownik Kliniki: dr hab. n. med. Agata Szulc
⁴I Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Kierownik Kliniki: prof. dr hab n. med. Jacek Dadan
⁵Wyższa Szkoła Zawodowa Ochrony Zdrowia TWP w Łomży
Rektor: prof. dr Witold Wincenciak

Summary
Introduction. Colorectal cancer is one of the most common cancers in Poland. It is a disease that requires the implementation of low-cost, readily available screening methods, allowing for early diagnosis. Determination of lysosomal exoglycosidases activity, in particular N-acetyl-β-D-hexosaminidase (HEX) and its isoenzymes A (HEX A) and B (HEX B) by thermal colorimetric method provides an opportunity for early detection of colorectal cancer. It is necessary, however, to confirm its value by comparison to the reference methods.
Aim. Comparison of thermal colorimetric and isoelectrophocusing methods for the determination of HEX isoenzymes in patients with colorectal cancer.
Material and methods. Colon cancer (G2 degree of maturity) and control tissues were obtained from 15 patients who underwent a tumor surgery. A control tissues were taken from the same patient’s colon areas at the margin of ileotomy. Total HEX and HEX B activity was determined by the thermal colorimetric method of Marciniak et al. HEX A activity was calculated from the difference between the total HEX activity and activity of thermostable HEX B. Quantification of HEX A and B activity in polyacrylamid gells after isoelectrofocusing was performed according to Borzym-Kluczyk et al.
Results. The thermal colorimetric and isoelectrofocusing methods give consistent results for the activity of HEX A and HEX B in colon adenocarcinoma and macroscopically unchanged remote colon tissue fragments.
Conclusions. Colorimetric method as a cheaper, faster and easier, may be applied to routine diagnostics in a large number of samples.

Wśród wszystkich nowotworów złośliwych występujących w Polsce w 2008 roku, rak jelita grubego zajmował czwarte miejsce u mężczyzn i piąte u kobiet pod względem zachorowalności, a trzecie miejsce zarówno u kobiet, jak i mężczyzn pod względem umieralności (1). Przyczyną wysokiej umieralności na raka jelita grubego w Polsce (i na świecie) jest duże zaawansowanie procesu nowotworowego w momencie zgłoszenia się pacjenta do lekarza (2). Wysoka umieralność z powodu raka jelita grubego wynika z braku skutecznych, ogólnie dostępnych metod diagnostycznych, umożliwiających wykrycie nowotworu w stadium jak najwcześniejszym, dających możliwość odpowiednio wczesnego podjęcia leczenia i tym samym zwiększających szansę pacjenta na wyleczenie.

HEX to najaktywniejsza egzoglikozydaza o największej wartości diagnostycznej wśród egzoglikozydaz lizosomalnych przebadanych przez nas w raku jelita grubego (2-5). Wyniki badania aktywności HEX, HEX A i HEX B w surowicy krwi i moczu chorych na raka jelita grubego sugerują możliwość wykorzystania oznaczenia aktywności HEX, HEX A i HEX B w rozpoznaniu raka jelita grubego we wczesnej fazie jego rozwoju (4).

Stosowana przez nas metoda oznaczania izoenzymów HEX w płynach biologicznych oparta na denaturacji cieplnej HEX A stwarza niebezpieczeństwo częściowej denaturacji również HEX B, co może wpływać na wyniki oznaczania obu izoenzymów HEX. Dlatego w tym samym materiale tkankowym, równolegle do oznaczenia kolorymetrycznego, oznaczyliśmy aktywności HEX A i B referencyjną metodą elektroogniskowania. W metodzie referencyjnej zastosowaliśmy materiał tkankowy, ponieważ nie było możliwe przeprowadzenie izoelektroogniskowania izoenzymów HEX w płynach biologicznych.

Materiał badany stanowiły fragmenty okrężnicy (0,3-0,5 g) pobrane z gruczolakoraka jelita grubego o stopniu dojrzałości komórkowej G2 od 15 chorych w wieku od 39 do 82 lat (średnia 68,39 ± 11,34 lat). Fragmenty tkanki niezmienione nowotworowo pobrano od tych samych pacjentów ze skraju nacięć jelita oddalonych o ok. 5 cm od zmiany nowotworowej podczas tych samych zabiegów operacyjnych wykonanych w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Bioetycznej (RI-003/300/2006).

Fragmenty tkanek opłukiwano wodą z kranu, a następnie, zawieszano w oziębionym 0,15 M KCl zawierającym 0,2% trytonu X-100, w stosunku wagowo-objętościowym 1:9 i homogenizowano przy pomocy homogenizatora nożowego ULTRA-TURRAX T8 IKA-Werke w naczyniach obłożonych lodem. Homogenaty wirowano przy 10 000 x g w ciągu 30 min w temperaturze +4°C. Płyn nadosadowy przechowywano w temperaturze -80°C.

HEX A i HEX B oznaczano metodą termiczno-kolorymetryczną Marciniak i wsp. (6) w następujący sposób: do 10 μl odpowiednio rozcieńczonego płynu nadosadowego uzyskanego po odwirowaniu homogenatu z gruczolakoraka lub odległej tkanki jelita grubego, dodawano 40 μl 0,1 M buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 4,7 i 30 μl 20 mM roztworu substratu (p-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozoaminidu, Sigma, St. Louis, MO, USA) w 0,1 M buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 4,7. Mieszaninę inkubowano 60 minut w temperaturze 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 200 μl 0,2 M buforu boranowego o pH 9,8. W celu oznaczenia aktywności HEX B: do 10 μl odpowiednio rozcieńczonego płynu nadosadowego dodawano 40 μl 0,1 M buforu fosforanowocytrynianowego o pH 4,7 i preinkubowano 180 minut w 50°C celem dezaktywacji termolabilnego HEX A, a następnie dodawano 30 μl 20 mM roztworu substratu i inkubowano 60 minut w temperaturze 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 200 μl 0,2 M buforu boranowego o pH 9,8. Aktywność HEX A obliczano z różnicy między całkowitą aktywnością HEXa aktywnością termostabilnego HEX B (HEX A = HEX – HEX B). Aktywność HEX B, odpowiadającą ilości uwolnionego p-nitrofenolu z p-nitrofenylo-N-acetylo-β-glukozoaminidu, mierzono w 405 nm, przy użyciu czytnika płytek EL_X800 i programu komputerowego KC junior (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA).

Izoformy izoenzymów A i B N-acetyloheksozoaminidazy elektroogniskowano na płaskich 5% żelach poliakryloamidowych przy pomocy aparatu Multiphor II (Pharmacia Biotech), z amfoliną o pH 3,5-9,0 (2%) według Borzym--Kluczyk i wsp. (7). Na bibułę filtracyjną Whatmann 3 (0,5 × 1 cm) nakładano 10-15 μl zatężonego nadsączu i bibułę filtracyjną umieszczano na powierzchni żelu między anodą i katodą. Zbiornik anodowy napełniano 2,0% H₂SO₄, a katodowy 0,4% wodnym roztworem etanoloaminy. Izoelektroogniskowanie przeprowadzano przez 2-6 godzin w 4-10°C. Po rozdziale, barwę spowodowaną aktywnością izoform HEX A i B heksozoaminidazy wywoływano przez umieszczenie żeli w 100 ml 0,1 M buforu cytrynianowego o pH 4,3 zawierającego 15 mg α-naftolo- -AS-BI-N-acetylo-β-glukozoaminidu (Sigma) oraz 100 mg Fast Garnet (Sigma) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Zabarwione żele przechowywano zamknięte w woreczkach z folii polietylenowej w mieszaninie kwasu octowego, metanolu i glicerolu. Przed oznaczaniem densytometrycznym żele były suszone. Równocześnie z homogenatami zawierającymi izoformy HEX na żele poliakrylamidowe nanoszono standardy białek (Broad pI Kit, pH 3,5-10; Amersham Pharmacia Biotech). Wzorcowe białka o określonym punkcie izoelektrycznym (pI) barwiono Coomassie Brillant Blue. Po barwieniu na aktywność enzymatyczną i białko, każdy żel poddawano analizie densytometrycznej przy pomocy programu Gene Tools (Syngene).

Na podstawie pomiarów densytometrycznych żeli poliakrylamidowych zabarwionych na aktywność heksozaminidazy po rozdziale izoelektroforetycznym izoform HEX A i HEX B (ryc. 1a, 1b) w nadsączach tkanki jelita grubego pobranej z dala od guza stwierdziliśmy tendencję do przewagi aktywności HEX A nad HEX B (p = 0,14815), natomiast w tkance gruczolakoraka jelita grubego istotną przewagę aktywności HEX A nad HEX B (p < 0,0002) (ryc. 2a). Oznaczając aktywność HEX B metodą termiczną, a następnie obliczając aktywność HEX A z różnicy między całkowitą aktywnością HEXa aktywnością termostabilnego HEX B, obserwowaliśmy istotnie wyższe aktywności HEX A niż HEX B zarówno w tkance jelita grubego odległej od guza (p < 0,0001), jak i w tkance gruczolakoraka jelita grubego (ryc. 2b).

Próby wykorzystania aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w diagnostyce nowotworów nerek, trzustki i mózgu stały się podstawą do podjęcia przez nasz zespół badań nad wykorzystaniem aktywności egzoglikozydaz lizosomalnych w diagnostyce raka jelita grubego, jako jednego z najczęstszych nowotworów przewodu pokarmowego (3, 4, 7, 9-12).

Badając aktywność HEX, HEX A i HEX B metodą termiczno-kolorymetryczną Marciniak i wsp. (6) w surowicy krwi i moczu chorych z rakiem jelita grubego (3, 4), stwierdziliśmy, że u chorych z gruczolakorakiem jelita grubego istotnie rośnie aktywność HEX, HEX A i HEX B w surowicy krwi i HEX A w moczu we wczesnej fazie rozwoju raka jelita grubego, w porównaniu do grupy kontrolnej. Istotny wzrost aktywności HEX i jej izoenzymów w płynach ustrojowych wskazuje na możliwość wykorzystania tych egzoglikozydaz w rozpoznaniu raka jelita grubego we wczesnej fazie jego rozwoju (4). Stwierdziliśmy, że oznaczenie aktywności HEX, HEX A i B metodą termiczno-kolorymetryczną w surowicy krwi i moczu chorych z gruczolakorakiem jelita grubego ma dużą wartość diagnostyczną i cechuje się dużą czułością oraz specyficznością metody (3, 4).

Stosowana przez nas metoda termiczno-kolorymetryczna oznaczania izoenzymów HEX w płynach biologicznych nie daje pewności, że nastąpiła całkowita denaturacji HEX A i że nie nastąpiła częściowa denaturacja HEX B, co może wpływać na wyniki oznaczania obu izoenzymów HEX. Dlatego równolegle do oznaczenia kolorymetrycznego oznaczyliśmy aktywności HEX A i B po rozdziale metodą elektroogniskowania w płaskich żelach poliakryloamidowych materiału pochodzącego z tkanki. W tej metodzie aktywne są zarówno HEX A, jak i HEX B.

Oznaczając HEX A i HEX B w tkance jelita grubego przy pomocy izoelektroogniskowania oraz metodą termiczną (ryc. 2a, b) stwierdziliśmy, że obydwie metody dają zbliżone wyniki. Jest to zgodne z doniesieniem Borzym-Kluczyk i wsp. (9), którzy porównując aktywność HEX A i B w tkance raka nerki, doszli do wniosku, że kolorymetryczne oznaczenie HEX A i B daje wyniki zgodne z uzyskanymi przy pomocy izoelektroogniskowania.

Uzyskane przez nas wyniki sugerują, że aktywności HEX A i HEX B w gruczolakoraku jelita grubego mogą być oznaczone z podobną dokładnością z zastosowaniem metody immunologicznej (13), izoelektroogniskowania, jak i metody termicznej (ryc. 2a, b), z tym że metoda termiczna jest najszybszym i najtańszym sposobem określenia aktywności HEX A i B nadającym się do badań rutynowych dużych ilości próbek biologicznych.

» Ocena aktywności izoenzymów A i B N-acetylo-β-D-heksozoaminidazy w tkankach raka jelita grubego