
	current issue 2/2013

about the journal	publishing	subscription	archive	contact

Markery laboratoryjne przewlekłej niewydolności nerek oznaczane w surowicy i w moczu^a)

*Barbara Lisowska-Myjak

Serum and urinary laboratory markers for chronic kidney disease

Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Dariusz Sitkiewicz

Summary
Chronic Kidney Disease (CKD) represents an evolving process which follows the initial renal insult and is characterized by progressive scarring that ultimately affects all structures of the kidney. The analysis of literature data demonstrates the role of numerous proteins, specifically related to the pathogenesis and development of successive stages of CKD. The methods of searching for new proteins as candidates for CKD markers, develop in two directions. Firstly, it is the association of particular proteins with recognized role in the pathogenesis of renal disease with specific clinical manifestations and secondly, using a proteomic approach and the latest developments in the field of protein research, the comparison of expression of all proteins present in the kidney and urine of healthy individuals and patients with renal disease, serves to identify diagnostically specific marker proteins. The development of laboratory guidelines on the use of these proteins as sensitive markers of kidney function must be preceded by numerous clinical studies in patients. The complex pathogenesis and development of CKD suggest that it will be not a single marker, but a strategic combination of selected proteins determined in serum and urine making up a „panel”, reflecting the state of renal function at successive stages of disease, useful for monitoring, prognosticating, and selecting effective treatment.
The aim of this article is to review the markers for impaired renal function now used in the medical laboratory as well as new promising candidates. The markers are measured in either serum (creatinine, cystatin C, ADMA, NGAL) or urine (proteinuria, cytokins, complement, KIM-1, NGAL, MMPs, TIMPs, PAI-1, AngII, ET-1, tTg) to assess the decrease in GFR and interstitial inflammation and fibrosis in the course of CKD.

Key words: chronic kidney disease, proteinuria, creatinine, renal inflammation, renal fibrosis

Przewlekła niewydolność nerek ( Chronic Kidney Disease – CKD) jest powszechną, dotyczącą wszystkich grup wiekowych, postępującą chorobą, prowadzącą w kolejnych etapach do niszczenia struktur i nieodwracalnej utraty funkcji nerek (1, 2, 3, 4).

W ostatnich latach można zauważyć szczególny wzrost zainteresowania klinicystów efektywną ochroną przed skutkami CKD, opartą na wczesnym wykrywaniu zmian patologicznych, ocenie intensywności ich rozwoju, ustaleniu rokowania oraz wprowadzeniu satysfakcjonującego leczenia. Realizacja tych zadań napotkała jednak na brak odpowiednio czułych i specyficznych dla lokalizacji anatomicznej w nerce oraz dla kolejnych etapów uszkodzenia jej funkcji markerów laboratoryjnych (4, 5).

W praktyce klinicznej dla różnicowania kolejnych etapów CKD wykorzystuje się ocenę spadku wartości GFR ( Glomerular Filtration Rate – GFR) (5, 6, 7). Utrata funkcji nerek w przebiegu CKD wiąże się istotnie z procesami zapalenia i włóknienia śródmiąższu. Źródłem tych zmian patologicznych mogą być choroby kłębuszków, niekorzystnie zmieniające środowisko komórek kanalika, włączając proteinurię (1, 2, 5).

Liczne badania eksperymentalne z zakresu biologii molekularnej, genetyki i proteomiki ujawniły nowych kandydatów na markery CKD, specyficznie powiązanych z uszkodzeniem kłębuszka oraz procesami zapalenia i włóknienia miąższu nerek w przebiegu kolejnych etapów choroby. Parametrów tych poszukuje się nie tylko w surowicy, ale także w moczu, jako materiale klinicznym bezpośrednio związanym z lokalnymi zmianami patologicznymi w nerce. Podkreśla się znaczenie znalezienia „panelu” markerów, różniących się między sobą specyficznością dla poszczególnych segmentów nefronu, źródłem pochodzenia, udziałem w procesach zapalenia i włóknienia, ekspresją w nerce oraz stężeniem w moczu i w surowicy.

W przedstawionej pracy zaprezentowano przegląd obecnie stosowanych i nowych markerów oznaczanych w surowicy (kreatynina, cystatyna C, ADMA, NGAL) i w moczu (proteinuria, cytokiny, komplement, KIM-1, NGAL, MMPs, TIMPs, PAI-1, AngII, ET-1, tTg), a także przeanalizowano ich znaczenie diagnostyczne dla oceny spadku GFR oraz rozwoju zapalenia i włóknienia miąższu w przebiegu przewlekłej niewydolności nerek.

Cechy idealnego markera dla wykrywania i oceny CKD

Idealny marker dla wykrywania i oceny progresji CKD powinien (1, 3, 8):

– wykazywać specyficzność diagnostyczną dla chorób nerek,

– korelować z histologicznymi wynikami biopsji nerek,

– identyfikować wczesne etapy uszkodzenia nerek, wyprzedzając istotną utratę funkcji nerek (tj. przed spadkiem GFR <60 ml/min/1,73 m²),

– informować o rozpoczęciu i kolejnych etapach pogarszania funkcji nerek,

– oceniać prognozę rozwoju choroby nerek.

Cechy laboratoryjne idealnego markera dla oceny CKD powinny dotyczyć:

– wysokiej czułości pomiaru, ułatwiającej wykrycie niewielkich zmian funkcji nerek,

– ściśle ustalonej wartości progowej, dla umożliwienia wykazania progresji i regresji uszkodzenia,

– nieinwazyjności dla pacjenta,

– praktycznej metody oznaczenia przy pomocy szybkich, dokładnych, tanich i ogólnodostępnych testów, przydatnych do przeprowadzenia pomiarów w dużej ilości próbek oraz ich porównania między różnymi laboratoriami.

Parametry laboratoryjne oznaczane w surowicy oceniające spadek GFR w przebiegu CKD

Zgodnie z ustaleniami NKF-K/DOQI, różnicowanie kolejnych etapów CKD opiera się na ocenie spadku wartości GFR. Najbardziej czułe i precyzyjne metody laboratoryjne do pomiaru tego wskaźnika wymagają podawania markerów egzogennych, jak inulina, EDTA, znakowane ¹²⁵J związki radioaktywne – Iohexol, Iothalamate. Substancje te są wprawdzie łatwo filtrowane w kłębuszkach, nie ulegają sekrecji lub reabsorpcji w kanalikach i nie zmieniają funkcji nerek, ale ich rutynowe wykorzystanie jest kosztowne, niepraktyczne, trudne i kłopotliwe zarówno dla pacjenta, jak i dla wykonującego badanie. Klirens endogennej kreatyniny ma także ograniczone znaczenie, ponieważ w przebiegu CKD odpowiednio do spadku filtracji kłębuszkowej, kreatynina ulega sekrecji przez komórki cewek nerkowych, i konsekwentnie obliczona wartość klirensu przekracza rzeczywistą filtrację kłębuszkową (2, 5, 6).

Niezmiennie od wielu lat, najbardziej powszechną alternatywą, ułatwiającą rutynowe oszacowanie GFR jest oznaczanie stężenia kreatyniny w surowicy.Coraz więcej dowodów potwierdza jednak niedoskonałość tego markera dla ilościowej oceny lub monitorowania CKD. Wahania stężenia kreatyniny w surowicy nie są ani czułą, ani specyficzną odpowiedzią na niewielkie zmiany GFR, a ich wykrycie jest możliwe dopiero po utracie 50% funkcji nerek. Ponadto poziom kreatyniny w surowicy zależny jest od masy mięśniowej i przyjmowanej diety – osoby starsze, niedożywione, kobiety, wegetarianie mają niższy poziom kreatyniny w surowicy.

Propozycją zwiększenia czułości diagnostycznej oznaczania stężenia kreatyniny w surowicy są równania matematyczne, oceniające e-GFR (estimated GFR, dla odróżnienia od klasycznie ocenianego GFR) z uwzględnieniem dodatkowych indywidualnych parametrów charakteryzujących pacjenta. Najbardziej powszechnym jest wzór Cockrofta – Gaulta, obejmujący obok stężenia kreatyniny w surowicy, wiek i masę ciała. Za bardziej wiarygodny, zawierający obok stężenia kreatyniny w surowicy informacje o wieku, płci, rasie, masie ciała oraz o stężeniu w surowicy mocznika i albuminy uznaje się wzór MDRD ( The Modification of Diet in Renal Disease). Pomimo różnej kompozycji składników tych równań, podstawą do ich obliczenia pozostaje ocena stężenia surowiczej kreatyniny, zawierająca niedokładne i nieprecyzyjne informacje dotyczące wczesnego uszkodzenia nerek. Należy także podkreślić, że obliczenia matematyczne mogą być przydatne jedynie u pacjentów ze stabilnym poziomem tego parametru w surowicy (5, 6, 7).

Mimo że stężenie kreatyniny w surowicy jest słabym odpowiednikiem GFR, nawet niewielki wzrost stężenia tego parametru, oceniany prospektywnie u indywidualnych pacjentów może wskazywać na dewastacyjne zmiany w nerkach. Wzrost surowiczej kreatyniny>15% wydaje się być istotny i niezależny od zmienności biologicznej lub analitycznej, jest uznawany za dobrą metodę monitorowania wczesnych zmian w nerkach jeszcze w zakresie wartości prawidłowych tego parametru (7, 9).

Wykazano wysoki stopień zmienności oznaczenia kreatyniny w surowicy między laboratoriami oraz wpływ na wynik jej oznaczenia substancji interferujących (ketony, glukoza wywołują wzrost, bilirubina spadek rzeczywistego poziomu kreatyniny). W celu zniwelowania tych różnic oraz wobec wzrastającego na całym świecie znaczenia diagnostycznego oznaczania kreatyniny w surowicy, postuluje się wprowadzenie wspólnych międzynarodowych standardów kalibracyjnych (9).

Badania na dużą skalę ujawniły, że wzrost stężenia cystatyny C w surowicy jest lepszym od kreatyniny markerem spadku filtracji kłębuszkowej dla rozpoznawania wczesnej dysfunkcji nerek oraz identyfikacji progresywnych zmian w przebiegu choroby. Parametr ten jest endogennym inhibitorem proteinaz cysteinowych, produkowanym przez wszystkie komórki jądrzaste i uwalnianym do krwi. Ze względu na stały stopień produkcji, niski ciężar (13,3 kD) i dodatni ładunek cząsteczki białko to ulega łatwej filtracji do moczu pierwotnego. Stężenie cystatyny C nie zależy od wieku, płci, rasy, masy ciała (4, 5).

W ostatnich 2 dekadach wiele badań poświęcono roli diagnostycznej ADMA ( asymmetric dimethylarginine – asymetrycznej dwumetyloargininie) w różnych etapach rozwoju CKD. ADMA jest końcowym produktem metabolicznym posttranlacyjnej metylacji reszt argininy (stałego procesu modyfikacji białek w cytoplazmie komórek wielu tkanek), który po wytworzeniu przenika do przestrzeni pozakomórkowej a dalej do krwi, gdzie wykazuje właściwości endogennego inhibitora syntazy NO. Obniżona biodostępność NO jest jedną z głównych przyczyn progresji uszkodzenia nerek. Wzrost stężenia ADMA w surowicy chorych z CKD wykazuje ujemną korelację z GFR i jest silnym niezależnym markerem ryzyka progresji do schyłkowej niewydolności nerek i śmierci. Nie wiadomo, czy wzrost tego parametru u chorych z CKD jest konsekwencją wzrostu syntezy czy raczej spadku klirensu nerkowego lub enzymatycznej degradacji tego związku (10, 11).

Według wstępnych badań, użytecznym markerem oznaczanym w surowicy dla ilościowej charakterystyki CKD, szczególnie w zaawansowanym etapie choroby, może być białko NGAL ( Neutrophil-Gelatinase Associated Lipocalin) – lipokalina, 25 kD białko przyłączone kowalencyjnie do żelatynazy ludzkich neutrofilów. Oznaczane w surowicy wykazuje właściwości czułego, specyficznego wskaźnika predykcyjnego rozwoju wczesnych zmian w nerce w przebiegu ostrego uszkodzenia nerek. Na wzrost stężenia NGAL w surowicy krwi, obok produkcji tego białka przez nerki, prawdopodobny wpływ mają także komórki biorące udział w odpowiedzi immunologicznej (neutrofile, makrofagi) oraz spadek GFR, przyczyniający się do spadku klirensu i nagromadzenia się tego białka w krążeniu. Niejasne jest, w jakim stopniu spadek funkcji nerek w przebiegu CKD wpływa na akumulację surowiczej NGAL (12).

Laboratoryjne markery CKD wykrywane w moczu

Współczesne dane literaturowe pozwalają na wyłonienie 3 grup parametrów laboratoryjnych oznaczanych w moczu, których przenikanie do nerki lub lokalna synteza oraz pełnione funkcje biologiczne mogą świadczyć o rozległości i intensywności uszkodzenia nerek:

1. Białko całkowite oraz indywidualne białka pochodzenia osoczowego lub białka strukturalne nerki.

2. Parametry oceniające rozwój stanu zapalnego w nerce.

3. Parametry związane z procesem włóknienia nerek.

Rola diagnostyczna oznaczania białka całkowitego oraz indywidualnych białek w moczu dla różnicowania kolejnych etapów CKD

Proteinuria jest konsekwencją zwiększonej filtracji białek osocza do płynu kanalikowego oraz ich zaburzonej reabsorpcji przez komórki nabłonka kanalika proksymalnego. Obydwa te procesy wpływają na jakościowy i ilościowy skład białek w moczu (9, 13, 14).

Wzrost wydalania białka całkowitego z moczem powyżej 0,5 g/24 h jest nie tylko uznanym i praktycznie stosowanym markerem ostrości uszkodzenia kłębuszka, ale także niezależnym czynnikiem ryzyka, aktywnie powiązanym z patogenezą progresywnego włóknienia kanalikowo-miąższowego oraz silnym wskaźnikiem predykcyjnym przebiegu nefropatii i rozwoju schyłkowej niewydolności nerek. Komórki kanalika nerkowego eksponowane na wzrost ilości filtrowanych białek osocza ulegają toksycznemu uszkodzeniu. Jawna proteinuria jest objawem utrwalonego uszkodzenia nerek, istotnie powiązanym ze spadkiem GFR. Chorzy z wysokim stopniem proteinurii w wyniku przewlekłej choroby kłębuszków są bardziej narażeni na rozwój przewlekłego uszkodzenia miąższu nerek niż porównywalna grupa z niskim wydalaniem białka lub bez proteinurii. Wiele badań klinicznych i eksperymentalnych wykazało istotną korelację między stopniem proteinurii, progresją uszkodzenia nerek i wzrostem patologii morfologicznej w nerce (15, 16, 17).

Różnice między wielkością i ładunkiem cząsteczek białek osocza przenikających do moczu pierwotnego mogą być źródłem bardziej szczegółowych informacji o intensywności i rozległości uszkodzenia błony filtracyjnej. Powszechnie akceptowany jest pogląd, że albuminuria jest odzwierciedleniem funkcjonalnych i potencjalnie odwracalnych nieprawidłowości zapoczątkowanych przez hiperfiltrację w kłębuszku. Wartość graniczna 200 μg/min różnicuje pacjentów z albuminurią i proteinurią, reprezentujących odmienne zagrożenia. Mikroalbuminurię (wzrost wydalania albuminy z moczem między 20 a 200 μg/min lub 30-300 mg/24 h) zidentyfikowano jako nowy czynnik ryzyka sercowo-naczyniowego i nerkowego, zarówno u pacjentów z cukrzycą, jak bez cukrzycy. Wzrost wydalania albuminy z moczem powyżej 200 μg/min (makroalbuminuria) oznacza uszkodzenie filtru kłębuszkowego, początek jawnej proteinurii oraz progresję choroby nerek i zmian naczyniowo-sercowych (9, 18).

Cennymi markerami laboratoryjnymi służącymi zróżnicowaniu ostrości zmian selektywności rozmiaru w kłębuszku oraz ocenie stopnia progresji chorób nerek u pacjentów z jawną nefropatią, mogą być białka o wysokiej masie cząsteczkowej ( High Molecular Weight – HMW protein) i wysokim promieniu cząsteczki, jak IgG (150 kD, 55 A) i alfa-2-makroglobulina (720 kD, 90 A) lub IgM (900 kD, 120 A). Wzrost wydalania z moczem tak dużych białek osocza koreluje z ostrością uszkodzenia histologicznego i może lepiej przepowiadać progresję zmian w nerkach oraz różnicować choroby kłębuszków niż ocena wydalania białka całkowitego w moczu (14, 19).

Kluczowym składnikiem bariery kłębuszkowej, wartościowym parametrem powiązanym z patogenezą i progresją proteinurii są podocyty, których obecność w moczu świadczy o stopniu destrukcji utworzonej przez nie błony szczelinowatej. Długotrwałe lub nasilone działanie czynników patogennych o różnym charakterze (immunologicznym, toksycznym, mechanicznym) powoduje oddzielenie podocytów od błony podstawnej i ich utratę z moczem – podocyturię.Intensywne badania mające na celu zrozumienie biologicznej roli podocytów, zwróciły uwagę na istotną rolę białek łączących funkcjonalnie te komórki z barierą kłębuszkową. Należą tu: nefryna, podocyna, alfa-aktinina-4, integryny, NEPHI, białka ZO-1( zonula occludens-1) i CD2AP ( CD2-associated protein), dystroglikan. Poszukiwanie obecności w moczu tych białek strukturalnych, powiązanych z konstrukcją bariery kłębuszkowej, może świadczyć o rozległości uszkodzenia błony filtracyjnej (1, 15).

Podobnie wykrywanie w moczu białek typowych dla macierzy pozakomórkowej ( extracellular matrix – ECM) może dostarczać informacji o wzroście syntezy lub destrukcji kolagenowych i niekolagenowych białek tam zlokalizowanych. Tenasciny są rodziną dużych oligomerycznych glikoprotein występujących w ECM kręgowców, reprezentują ważną klasę nie-kolagenowych białek pozakomórkowych, wywierających wpływ na biologiczne czynności komórek. Wielofunkcyjna rola tenascin wynika prawdopodobnie z podobieństwa powtarzających się w nich domen, z takimi białkami jak fibrynogen i fibronektyna. W moczu pacjentów z chorobami nerek wykazano 6-krotny wzrost stężenia tych białek w porównaniu z kontrolą. Badania eksperymentalne wskazały także skuteczność diagnostyczną oceny wydalania kolagenu typu IV oraz fibronektyny w moczu, parametrów pomocnych w diagnozowaniu zmienionej macierzy pozakomórkowej we wczesnym okresie rozwoju CKD (20, 21, 22, 23).

Parametry laboratoryjne w moczu dla oceny rozwoju stanu zapalnego w miąższu nerek

Uszkodzenie komórek kanalika proksymalnego i zapalenie śródmiąższu uważa się za wcześniejszy objaw, poprzedzający rozwój odkładania macierzy pozakomórkowej i włóknienia śródmiąższu.

Główną rolę w rozwoju zapalenia miąższu nerek pełnią mediatory zapalenia – cytokiny, chemokiny, składniki układu komplementu. Wzrost ich stężenia w nerce w przebiegu CKD może wynikać ze wzrostu ich syntezy lub filtracji przez uszkodzony kłębuszek, wzrostu ekspresji genów nerkowych ze wzmożoną syntezą odpowiadających im peptydów w tkance nerkowej oraz dostarczania tych czynników do nerki przez napływające makrofagi (4, 24).

Rola diagnostyczna cytokin oznaczanych w moczu dla oceny lokalnych zmian zapalnych w nerce może być bardziej znacząca niż oznaczenia tych parametrów we krwi (25, 26).

MCP-1 ( monocyte chemoattractant protein-1) – pośredniczy w rekrutacji komórek zapalnych – monocytów//makrofagów i T limfocytów do przestrzeni kanalikowo-miąższowej w nerce. Przyciągane komórki w odpowiedzi wydzielają dodatkowo cytokiny i chemokiny, przyspieszając proces zapalenia i włóknienia. MCP-1 pełni rolę nie tylko chemoatraktanta, ale także niezależnie indukuje proces zapalenia w ludzkich komórkach śródbłonka kanalikowego, istotnie wpływając na uszkodzenie i destrukcję nerek. Wzrost lokalnej ekspresji i produkcji MCP-1 w nerce może mieć szczególne znaczenie dla procesów inicjacji i progresji uszkodzenia kanalikowo-miąższowego. Wykazano wzrost transkrypcji i translacji MCP-1 w komórkach nabłonka kanalika proksymalnego stumulowanego wysokimi stężeniami albuminy oraz ścisłe powiązanie między albuminurią, stężeniem MCP-1/CCL2 w moczu i infiltracją makrofagów do śródmiąższu w miejscu uszkodzenia (26, 27, 28, 29).

RANTES – chemotatraktant dla makrofagów, granulocytów i T-limfocytów, ulega ekspresji w różnych typach komórek w nerce (komórki mezangium, śródbłonek kanalika nerkowego, fibroblasty, limfocyty), odgrywa aktywną rolę w ostrym i przewlekłym zapaleniu nerek oraz w rozwoju uszkodzenia kanalikowo-miąższowego. Wzrost reabsorpcji albuminy i innych białek osocza przez komórki kanalika proksymalnego stymuluje zależną od stężenia i czasu oddziaływania dawki obciążającej zwiększoną produkcję RANTES (30).

Fraktalkina (CX3CL1) – może występować w dwóch formach: powiązana z błoną komórkową lub (po proteolitycznym odczepieniu od błony) jako rozpuszczalna glikoproteina. W eksperymentalnie wywołanych chorobach nerek z proteinurią wzmożona ekspresja genu fraktalkiny w komórkach kanalika, koreluje z dawką i czasem oddziaływania albuminy na komórki kanalika. Wykazano wzrost indukcji zarówno formy rozpuszczalnej, jak przyłączonej do błony sugerując, że fraktalkina może działać jako chemoatraktant oraz jako cząsteczka adhezyjna, indukująca adhezję i zatrzymanie leukocytów (31).

Białka układu komplementu – ze względu na dużą wielkość cząsteczek (podstawowy składnik C3 – m. cząst. około 200 kD) nie mogą być swobodnie filtrowane do przestrzeni Bowmana i światła kanalika, i nie są obecne w moczu osób zdrowych oraz pacjentów z niewielkimi uszkodzeniami nerek. Źródłem tych białek w nerce może być ich nieprawidłowa filtracja do moczu pierwotnego lub wewnątrznerkowa lokalna synteza. Zarówno nadmiar ultrafiltrowanych, jak i lokalnie syntetyzowane w komórkach kanalika proksymalnego białka układu komplementu pełnią rolę w powstawaniu i rozwoju stanu zapalnego oraz w uszkodzeniu kanalikowo-miąższowym w przebiegu CKD. Procesy te poprzedza wewnątrzkanalikowa aktywacja komplementu. W miejscu uszkodzenia składnik C3 ulega rozkładowi i następującym po sobie zmianom konformacyjnym, prowadzącym do tworzenia kompleksu C5b789 (C5b-9 – membrane attach complex – MAC), głównego mediatora przewlekłego uszkodzenia miąższu i progresywnego uszkodzenia funkcji nerek. Wzrost wydalania składników komplementu z moczem u pacjentów z proteinurią istotnie koreluje z wydalaniem białka całkowitego i spadkiem funkcji nerek. Wzrost wydalania z moczem pacjentów z proteinurią C5b-9 może być markerem prognostycznym rozwoju niewydolności nerek (33, 41).

Przyspieszona aktywacja C3 w kanalikach proksymalnych w chorobach z proteinurią oraz w niedoczynności nerek może być wynikiem zwiększonego wewnątrzkanalikowego katabolizmu białek, z towarzyszącym wzrostem syntezy amoniaku – aktywatora alternatywnej ścieżki komplementu (32, 33).

KIM-1 (Kidney Injury Molecule-1) jest typem 1 glikoproteiny transbłonowej, zawierającej charakterystyczną ektodomenę. Białko to nieobecne w moczu u zdrowych osób, ulega zwiększonej ekspresji w nerce w wyniku uszkodzenia wywołanego zapaleniem. Odczepiona przez metaloproteazy, zewnątrzkomórkowa część KIM-1 jest wykrywana w moczu, koreluje z ekspresją KIM-1 w nerce, dzięki czemu może być przydatnym parametrem dla oceny rozległości uszkodzenia narządu. Przypuszcza się, że bezpośrednią przyczyną indukcji KIM-1 jest wzrost stężenia białka w ultrafiltracie kłębuszkowym oraz obecność wałeczków białkowych, sprzyjające niedrożności kanalików, stresowi mechanicznemu oraz wzrostowi ciśnienia w kłębuszku. Niejasna jest rola biologiczna tego białka. Z jednej strony wzrost stężenia KIM-1 w nerce może być konsekwencją uszkodzenia kanalikowo-miąższowego, z drugiej natomiast białko to może aktywnie wpływać na przebieg uszkodzenia, przez interakcję z innymi białkami, tworząc warstwę zabezpieczającą na powierzchni komórek kanalika proksymalnego, ochraniając go przed tworzeniem wałeczków. Wzrost indukcji KIM-1 w nerce po niedotlenieniu, toksycznym uszkodzeniu oraz w ostrej proteinurii może być etapem pośrednim, wyprzedzającym dalszą serię niekorzystnych następstw w komórkach kanalików nerkowych, wywołanych ich ekspozycją na toksyczny bogato-białkowy filtrat kłębuszkowy (34).

NGAL ( neutrophil-gelatinase associated lipocalin) – ulega ekspresji na bardzo niskim poziomie w wielu ludzkich tkankach, włączając nerkę, tchawicę, płuca, żołądek, jelito. Jest natomiast jednym z maksymalnie indukowanych genów w nerce po jej niedotlenieniu oraz jest wczesnym markerem uszkodzenia nerek, ocenianym zarówno we krwi, jak w moczu. Wykazano ścisłą korelację między stężeniem NGAL w moczu i stopniem proteinurii. Znaczenie biologiczne tego parametru w nerce nie jest jasne. Wykrycie NGAL w proliferujących komórkach nabłonka sugeruje, że białko to może ulegać wzmożonej ekspresji w uszkodzonych kanalikach. Istnieje też hipoteza, że NGAL jest białkiem transportującym lub rezerwuarem dla żelaza uwolnionego z komórek kanalika (35, 36).

Parametry oceniające stopień włóknienia miąższu nerek

Oczywistym dowodem wzrostu akumulacji macierzy pozakomórkowej ( extracellular matrix – ECM) w miąższu nerek w przebiegu CKD jest zaburzona równowaga między syntezą i degradacją jej składników. Tempo i zakres niekorzystnych zmian zależy od szybkości i wielkości produkcji (z udziałem czynników transkrypcyjnych i procesów translacji) lub rozkładu jej składników (z udziałem proteaz i ich inhibitorów) oraz od czynników wpływających na podatność białek ECM na ich degradację (glikozylacja, stabilność białek inkorporowanych do macierzy). Ekspozycja komórek hodowlanych na białka surowicy wykazała wzrost produkcji pozakomórkowej fibronektyny i kolagenu, potwierdzając wpływ proteinurii na proces włóknienia nerek w przebiegu progresywnych chorób nerek (1, 3).

Z przemianą i kompozycją macierzy pozakomórkowej związane są enzymy proteolityczne i ich inhibitory:

– metaloproteinazy macierzy ( metalloproteinases matrix – MMPs), duża rodzina proteinaz (endopeptydaz zawierających cynk), zdolnych do degradacji nie tylko białek ECM, ale także cząsteczek sygnałowych, jak receptory czynników wzrostu i cząsteczki adhezyjne na powierzchni komórek. W oparciu o specyficzność substratową oraz cechy zgodności budowy sklasyfikowano 6 grup MMPs: kolagenazy, żelatynazy, stromelizyny, matrilizyny, błonowy typ MMPs, pozostałe MMPs – nie zakwalifikowane do żadnej z powyższych kategorii (37, 38).

– plazmina – proteza serynowa, syntetyzowana w wątrobie, w odpowiedzi na zapalenie ulega często przemieszczaniu do przestrzeni pozanaczyniowej, wpływa na regulację składu ECM, degraduje fibrynę, fibronektynę i lamininę (ale nie elastynę lub natywny kolagen), zdolna do aktywacji nieaktywnych form TGF-β i MMPs. Za aktywację plazminogenu do jego aktywnej formy plazminy odpowiadają aktywatory plazminogenu: t-PA (tkankowy typ aktywatora plazminogenu) i u-PA (aktywator plazminogenu typu urokinazy). O ile tPA, o silnym powinowactwie do fibryny, nie jest wystarczającym aktywatorem plazminogenu bez towarzyszącej fibryny, o tyle uPA nie przyłączający się do fibryny tworzy aktywną plazminę z plazminogenu w przestrzeniach pozanaczyniowych. uPA wykazuje silne powinowactwo do nieobecnego w zdrowej nerce receptora uPAR ( urokinase-type Plasminogen Activator Receptor). Znacząca ilość uPA produkowanego w kanalikach proksymalnych w zdrowej nerce jest wydalana z moczem (39, 40).

Inhibitory proteaz hamują aktywności wewnątrznaczyniowych oraz obecnych w przestrzeniach pozakomórkowych proteaz serynowych, przedstawiają złożone interakcje z macierzą, promując jej odkładanie w nerce.

– tkankowe inhibitory metaloproteinaz macierzy ( Tissue Inhibitor of MetalloProteinases TIMP-1 to 4), endogenne specyficzne inhibitory MMPs, przyłączają i hamują wszystkie MMPs, z wyjątkiem TIMP-1, który nie wykazuje zdolności hamowania MMP-14, -16, -24. Pomimo dobrze udokumentowanej, ważnej roli biologicznej MMPs i TIMPs w przebiegu procesów włóknienia w ostrych i przewlekłych chorobach nerek, lokalizacja tych białek w nerce oraz ustalenie wzajemnego związku między ich aktywnościami pozostaje ważnym problemem do wyjaśnienia. Na obecnym etapie nie wiadomo, w jakim stopniu zmienny skład MMPs i TIMPs w surowicy i w moczu wybiórczo dotyczy chorób różnych narządów, a w jakim relatywnie informuje o dysfunkcji nerek (37, 38).

– Inhibitor-1 aktywatora plazminogenu (PAI-1 plasminogen activator inhibitor-1)- 50 kD glikoproteina, członek rodziny SERPIN ( Serine Protease Inhibitor), pierwotny fizjologiczny inhibitor aktywatorów plazminogenu (t-PA i uPA). Hamuje zdolność przemiany plazminogenu w plazminę oraz MMPs do form aktywnych.

Nie wykryto obecności PAI-1 w zdrowej nerce, natomiast w ostrych i przewlekłych chorobach nerek, dzięki aktywności lokalnych i zewnątrznerkowych komórek zapalnych, inhibitor ten ulega szybkiej indukcji i produkcji w różnych komórkach wewnątrz nerki. Tworzy trwałe kompleksy z uPA i tPA, ulegając w ten sposób nieodwracalnemu zużyciu. PAI-1 niezależnie od funkcji inhibicyjnej dla tPA i uPA, silnie promuje proces włóknienia w nerce, wpływając na aktywację wielu proenzymów i czynników wzrostu, adhezję i migrację komórek oraz przebudowę i degradację macierzy. Wysoki poziom PAI-1 w nerce prawdopodobnie przepowiada zły i długotrwały przebieg choroby. We współczesnym piśmiennictwie przedstawiono wiele dowodów wskazujących na ważną rolę PAI-1 w procesach włóknienia nerek, aczkolwiek na obecnym etapie trwają badania nad ustaleniem szczegółowych patomechanizmów. Wykazano wzrost wydalania PAI-1 z moczem u osób z cukrzycowym zespołem nefrotycznym (41, 42).

Tkankowa transglutaminaza (tTg) – członek rodziny enzymów zależnych od jonów wapnia, powiązanych z licznymi chorobami płuc, wątroby, serca i nerek przebiegających z włóknieniem. tTg uwalniana przez komórki kanalika do przestrzeni pozakomórkowej w nerce wpływa na akumulację ECM, dzięki zdolności do tworzenia nieodwracalnych krzyżowych powiązań białek macierzy przez dwupeptydowe mosty ε (γ-glutamylo-lizynowe) między resztami glutaminy, zwiększeniu oporności krzyżowo powiązanych białek macierzy na proteolityczne działanie MMPs i kolagenaz oraz przyłączeniu nieaktywnej formy TGF-β do ECM i powierzchni komórek, co ułatwia jego aktywację. tTg jest dobrze udokumentowanym potencjalnym markerem biochemicznym dla oceny wzrostu depozytu ECM. Wzrost regulacji oraz wysoka korelacja tTg z dwupeptydem ε (γ-glutamylo-lizyny) wykazana w bioptatach nerek u pacjentów z CKD stwarza nadzieję, że równoczesne oznaczanie obu tych parametrów może tworzyć korzystny zestaw składający się na laboratoryjny parametr procesów włóknienia w nerce. Do tej pory brak jest jednak informacji o wykorzystaniu oznaczeń obu tych markerów w moczu w przebiegu chorób nerek (43, 44).

Chemokiny i ich receptory wpływają na proces włóknienia, poprzez rekrutację komórek zapalnych do przestrzeni kanalikowo-miąższowej oraz stymulację syntezy białek ECM przez sąsiadujące myofibroblasty. Najsilniejszy efekt włóknienia oraz wpływ na dynamikę tego procesu wywierają: TGF-β, TNF-alfa, endotelina-1, MCP-1/CCL2 i receptor CCR2, RANTES (CCL5) i receptor CCR1 (ale nie CCR5), m-CSF ( macrophage-colony stimulating factor), osteopontina, receptor 1 fraktalkiny (CX3 CR1), HGF ( Hepatocyte-Growth Factor) (24).

TGF-β (transformujący czynnik wzrostu) jest najważniejszą cytokiną promującą rozwój włóknienia we wszystkich narządach miąższowych, główny induktor gojenia i zdrowienia następstw uszkodzenia różnych tkanek. Wydzielany jako nieaktywny 25 kDa homodimer może ulegać lokalnej aktywacji. W przebiegu włóknienia wzrasta nie tylko produkcja, ale i aktywacja z latentnej do biologicznie aktywnej formy TGF-β.

Aktywowany TGF-β ułatwia akumulację macierzy pozakomórkowej przez aktywację fibroblastów do produkcji kolagenu typu I i typu IV oraz fibronektyny, syntezę integryn związanych z gromadzeniem macierzy na powierzchni komórek oraz pośredniczących w interakcjach makrofagów z komórkami miąższu, silną stymulację procesu EMT (transformację komórek śródbłonka i nabłonka kanalika), silną chemotaksję dla komórek zapalnych (odwrotnie, aktywowane makrofagi tkankowe i rekrutowane makrofagi stają się głównym źródłem TGF-β w uszkodzonej tkance), hamowanie syntezy proteinaz – MMPs i plazminy, wzrost syntezy inhibitorów proteinaz – TIMPs i PAI-1 oraz modulowanie aktywności tTg.

Ocenę wydalania TGF-β z moczem zaproponowano jako marker wewnątrznerkowej produkcji i aktywności tej cytokiny w nerce. Wzrost wydalania TGF-β z moczem wykazano w ostrym uszkodzeniu nerek oraz w różnych nefropatiach, najbardziej znaczący u pacjentów z silną proteinurią (45, 46).

Endotelina-1- (ET-1) – produkowana przez wiele komórek wewnątrz nerki (komórki śródbłonka naczyń i mezangium w kłębuszku, komórki kanalików, fibroblasty, makrofagi) i wydalana do moczu jest odbiciem jej produkcji w nerce. Wzrost ekspresji genu i wydalania ET-1 z moczem istotnie wiąże się z zakresem proteinurii i rozmiarem uszkodzenia nerek oraz z ujemną korelacją z GFR. Wpływ ET-1 na procesy włóknienia polega na zdolności do przyłączania fibroblastów śródmiąższowych, inicjowania ich proliferacji i tworzenia macierzy pozakomórkowej oraz na właściwościach chemotaktycznych dla makrofagów, konsekwentnie rozwijających sekwencję zdarzeń związanych z przebudową i włóknieniem śródmiąższu (47).

VEGF – ( Vascular Endothelial Growth Factor) proangiogenny czynnik wzrostu, dimeryczne białko skomponowane z podjednostek zawierających 121, 165, 189 lub 206 aminokwasów. Funkcje biologiczne VEGF w tkance nerkowej dotyczą remodelowania naczyń i tkanki nerek, stymulacji proteinurii, syntezy kolagenu w ECM oraz chemotaksji dla monocytów. VEGF-189 i VEGF-206 są głównie przyłączane do powierzchni komórek i macierzy pozakomórkowej, natomiast VEGF-121 i VEGF-165 są formami rozpuszczalnymi i ulegają wydalaniu. Ekspresja VEGF-165 występuje w wielu komórkach ludzkiej nerki (podocytach, komórkach kanalików nerkowych, kapilarach kłębuszka i okołokłębuszkowych). U pacjentów z przewlekłymi chorobami nerek wykazano ujemną korelację między klirensem kreatyniny i wydalaniem VEGF z moczem (47).

Ang II – jest ważnym wewnątrznerkowym czynnikiem sprzyjającym procesom zapalenia i włóknienia przez wpływ na wzrost ekspresji genów prozapalnych (IL-6, TNFα, MCP-1, RANTES) oraz genów sprzyjających procesom włóknienia (TGF-β i PAI-1). W odpowiedzi na uszkodzenie nerek udowodniono wzajemne powiązanie między Ang II i TNFα, wykazano wpływ Ang na lokalną ekspresję MCP-1 oraz stwierdzono wzajemne zależności między Ang II, TGF-β i PAI-1. Ang II może być dostarczana do nerki lub lokalnie tworzona z angiotensynogenu (dostarczanego lub syntetyzowanego wewnątrz nerki) przy udziale obecnych w nerce reniny i konwertazy angiotensyny. Podkreśla się większy ilościowy udział w nerce Ang II tworzonej lokalnie niż do niej transportowanej. Według najnowszych opinii, oznaczanie stężenia angiotensynogenu w moczu lepiej odzwierciedla ilość tworzonej Ang II wewnątrz nerki niż bezpośrednia ocena stężenia Ang II w moczu. Współczesne prace, mające na celu udoskonalenie metody ELISA do oznaczeń stężenia ludzkiego angiotensynogenu w moczu być może pozwolą na ujawnienie trudnego do identyfikacji wpływu Ang II na dewastacyjne procesy wewnątrz nerki (48, 49, 50).

W podsumowaniu nasuwa się stwierdzenie, że nie jest możliwe, aby jeden parametr laboratoryjny wykazywał cechy odpowiednio czułego i specyficznego markera wykrywania, oceny dynamiki zmian oraz prognozowania przebiegu kolejnych etapów CKD. Złożony patomechanizm powstawania i rozwoju choroby wymaga nie pojedynczego markera, ale raczej ich strategicznej kombinacji, tworzącej „panel” wyselekcjonowanych białek oznaczanych w surowicy i moczu.

Lawinowo zwiększająca się ilość publikacji, dotyczących poszukiwania nowych, czułych i specyficznych markerów laboratoryjnych, przydatnych do diagnozowania i ilościowej oceny dynamiki progresywnych zmian w nerce, świadczy o fundamentalnej potrzebie rozwiązania tego problemu na całym świecie.

^a)Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2007-2008 jako projekt badawczy N N405 2519 33.

Piśmiennictwo

1. Fogo AB: Progression versus regression of chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 281-284. 2. Shyam C, Duggal AK, Sunder S: Chronic kidney disease: a perspective. JIACM 2007; 8: 150-63. 3. Kisseleva T, Brenner DA: Fibrogenesis of parenchymal organs. Proc Am Thor Soc 2008; 5: 338-342. 4. Liu Y: Renal fibrosis: New insights into the pathogenesis and therapeutics. Kidney Int 2006; 69: 213-217. 5. MacGregor MS, Boag DE, Innes A: Chronic kidney disease: evolving strategies for detection and management of impaired renal function. QJ Med 2006; 99: 365-375. 6. Clark WF et al.: Evaluation of GFR estimating equations in the general community: implications for screening. Clin J Am Soc Nephrol 2006; 1: 787-795. 7. Narula CAS, Hooda CAK: Conservative management of chronic renal failure. MJAFI 2007; 63: 56-61. 8. Zoja C, Morigi M, Remuzzi G: Proteinuria and phenotypic change of proximal tubular cells. J Am Soc Nephrol 2003; 14: S36-S41. 9. Newman DJ, Thakkar H, Gallagher H: Progressive renal disease: does the quality of the proteinuria matter or only the quantity? Clin Chim Acta 2000; 297: 43-54. 10. Fliser D et al.: Asymmetrical dimethylarginine and progression of chronic kidney disease: the mild to moderate kidney disease study. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2449-2455. 11. Jacobi J, Tsao PS: Asymmetrical dimethylarginine in renal disease: limits of variation or variation limits? Am J Nephrol 2008; 28: 224-237. 12. Wheeler DS et al.: Serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a marker of acute kidney injury in critically ill children with septic shock. Crit Care Med 2008; 36: 1297-1303. 13. Haraldsson B, Sörensson J: Why do we not all have proteinuria? An update of our current understanding of the glomerular barrier. News Physiol Sci 2004; 19: 7-10. 14. Halbesma N et al.: Macroalbuminuria is a better risk marker than low estimated GFR to identify individuals at risk for accelerated GFR loss in population screening. J Am Soc Nephrol 2006; 17: 2582-2590. 15. Abbate M, Zoja C, Remuzzi G: How does proteinuria cause progressive renal damage? J Am Soc Nephrol 2006; 17: 2974-2984. 16. Eddy AA: Proteinuria and interstitial injury. Nephrol Dial Transplant 2004; 19: 277-281. 17. Tryggvason K, Pettersson E: Causes and consequences of proteinuria: the kidney filtration barrier and progressive renal failure. J Intern Med 2003; 254: 216-224. 18. Ruggenenti P, Remuzzi G: Time to abandon microalbuminuria? Kidney Int 2006; 70: 1214-1222. 19. Bakoush O et al.: High proteinuria selectivity index based upon IgM is a strong predictor of poor renal survival in glomerular diseases. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 1357-1363. 20. Hörstrup JH et al.: Elevation of serum and urine levels of TIMP-1 and tenascin in patients with renal disease. Nephrol Dial Transplant 2002; 17: 1005-1013. 21. Hsia HC, Schwarzbauer JE: Meet the tenascins: multifunctional and mysterious. J Biol Chem 2005; 280: 26641-26644. 22. Tonsho M et al.: Measurement of urine collagen type IV after kidney transplantation. Transplantation Proceedings 2000; 32, 1780. 23. Gwinner W, Jackle Meyer I, Stolte H: Origin of urinary fibronectin. Lab-invest 1993; 69: 250-5. 24. Benigni A, Remuzzi G: How renal cytokines and growth factors contribute to renal disease progression. Am J Kid Dis 2001; 37 (suppl 2): S21-S24. 25. Boor P et al.: Treatment targets in renal fibrosis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22: 3391-3407. 26. Mori T et al.: Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy. J Diab Compl 2003; 17: 11-15. 27. Morii T et al.: Increased urinary excretion of monocyte chemoattractant protein-1 in proteinuric renal diseases. Renal Fail 2003; 25: 439-444. 28. Viedt C, Orth S: Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the kidney: does it more than simply attract monocytes? Nephrol Dial Transplant 2002; 17: 2043-2047. 29. Eardley KS et al.: The relationship between albuminuria, MCP-1/CCL₂, and interstitial macrophages in chronic kidney disease. Kidney Int 2006; 69: 1189-1197. 30. Zoja C et al.: Protein overload stimulates RANTES production by proximal tubular cells depending on NF-κB activation. Kidney Int 1998; 53: 1608-1615. 31. Donadelli R et al.: Protein overload induces fractalkine upregulation in proximal tubular cells through nuclear factor κB- and p38 mitogen-activated protein kinase-dependent pathways. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 2436-2446. 32. Morita Y et al.: Complement activation products in the urine from proteinuric patients. J Am Soc Nephrol 2000; 11: 700-707. 33. Abbate M et al.: Complement – mediated dysfunction of glomerular filtration barrier accelerates progressive renal injury. J Am Soc Nephrol 2008; 19: 1158-1167. 34. Timmeren MM et al.: Tubular kidney injury molecule-1 in protein-overload nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol 2006; 291: F456-F464. 35. Bolignano D et al.: Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) is associated with severity of renal disease in proteinuric patients. Nephrol Dial Transplant 2008; 23: 414-416. 36. Mishra J et al.: Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 2534-2543. 37. Catania JM, Chen G, Parrish AR: Role of matrix metalloproteinases in renal pathophysiologies. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 292: F905-F911. 38. Gong R et al.: Hepatocyte growth factor modulates matrix metalloproteinases and plasminogen activator/plasmin oroteolytic pathways in progressive renal interstitial fibrosis. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 3047-3060. 39. Eddy AA, Fogo AB: Plasminogen activator inhibitor-1 in chronic kidney disease: evidence and mechanisms of action. J Am Soc Nephrol 2006; 17: 2999-3012. 40. Zhang G et al.: Plasmin (ogen) promotes renal interstitial fibrosis by promoting epithelial-to-mesenchymal transition: role of plasmin-activated signals. J am Soc nephrol 2007; 18: 846-859. 41. Eddy AA: Plasminogen activator inhibitor-1 and the kidney. Am J physiol Renal Physiol 2002; 283: F209-F220. 42. Torii K et al.: Diabetic nephropathy and plasminogen activator inhibitor-1 in urine samples. Rinsho Byori 2004; 52: 506-12. 43. Shweke N et al.: Tissue transglutaminase contributes to interstitial renal fibrosis by favoring accumulation of fibrillar collagen through TGF-ββ activation and cell infiltration. Am J Pathol 2008; 173: 631-642. 44. Johnson TS et al.: Tissue transglutaminase and the progression of human renal scarring. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 2052-2062. 45. Schnaper HW et al.: TGF-β signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 2003; 284: F243-F252. 46. Böttinger EP, Bitzer M: TGF-β signaling in renal disease. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2600-2610. 47. Grenda R et al.: ESCAPE Trial group. Urinary excretion of endothelin-1 (ET-1), transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and vascular endothelial growth factor (VEGF₁₆₅) in paediatric chronic kidney diseases: results of the ESCAPE trial. Nephrol Dial Transplant 2007; 22: 3487-3494. 48. Yamamoto T et al.: Urinary angiotensinogen as a marker of intrarenal angiotensin II activity associated with deterioration of renal function in patients with chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 2007; 18: 1558-1565. 49. Katsurada A et al.: Novel sandwich ELISA for human angiotensinogen. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 293: F956-F960. 50. Ruiz-Ortega M et al.: Angiotensin II: a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases. Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 16-20.

otrzymano/received: 2009-12-09
zaakceptowano/accepted: 2009-12-22

Adres/address:
*Barbara Lisowska-Myjak
Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa
tel.: (22) 57 20 735, fax: (22) 57 20 735
e-mail: basia.myjak@interia.pl

Paper Serum and urinary laboratory markers for chronic kidney disease at On-line Medical Library.